単一細胞（シングルセル）の遺伝子発現を解析（トランスクリプトーム解析; RNA seq）の論文では、下図のような、t-SNEをプロットした図がよく登場します。

このtSNE1、tSNE2というのは一体何でしょうか？

生物学者は、細胞の種類がどれくらいあるのかを知るためのアプローチのひとつとして、個々の細胞内ではどんな遺伝子がどれくらいの量だけ発現（DNAからｍRNAに転写されたり、さらにタンパク質に翻訳されたりすること）しているかを調べ、その結果に基づいてそれらの細胞を分類しようと考えます。

近年の急速な分析技術の進歩により、細胞や分子の性質を、集団の平均値としてではなく、一つひとつの細胞や分子の個性を維持したまま解析することが可能になりました。シングルセルRNA-seq解析では細胞集団の転写産物を1細胞ごとに網羅的に解析します。そのため、細胞集団を構成する細胞がどう分類できるかが未知のままでも、細胞集団を亜集団にクラスタリングして特徴を抽出することが可能です。(シングルセルRNA-seq解析 genble.com)

もし仮に細胞には遺伝子がたったの2つしかなくて、遺伝子Xと遺伝子Yの発現量を調べるだけで個々の細胞のプロファイリングができてしまうとしたら、X「軸」とY「軸」の2次元平面上にひとつひとつの細胞の遺伝子発現量をプロットすれば、細胞の種類の数だけクラスターが現れるでしょうから、目で見てわかりやすく話は簡単です。

しかしヒトの遺伝子数は2万以上もあり、実験によって多数の遺伝子に関する発現量のデータが得られます。これらのデータをそれぞれの遺伝子「軸」に関してプロットした結果（＝多次元空間に分布しているデータの様子）を、平面しか認識できない人間が「見る」ことはできません。そこで、個々の細胞が発現している複数の遺伝子の量のデータ（多次元データ）を、とある数学的な処方箋(t-SNE)を用いて2次元のデータに変換（次元の削減）してしまえば、個々の細胞を（tSNE1軸とtSNE2軸からなる）2次元平面上にプロットすることができて、どのようにクラスターをつくっているのか（＝どんな種類の細胞があるのか）その様子が見やすくなります。

t-SNE（てぃー すにー）は何の略？

t-distributed Stochastic Neighbor Embedding (t 分布型確率的近傍埋め込み)

t-SNEがどんなものかをざっくり言うと？

a new technique called “t-SNE” that visualizes high-dimensional data by giving each datapoint a location in a two or three-dimensional map.  (Maaten and Hinton, 2008 PDF)

この技術は、数百または数千次元のデータですら無理やり2次元の「マップ」に落とし込むという、ほとんど魔法のような能力を備えているために、機械学習の分野で幅広く普及しています。 (高次元のデータを可視化するt-SNEの効果的な使い方 DeepAge 2017-03-8)

上記サイトではパラメータを変えたときの結果を比較していて、非常に興味深いです。

t-SNEは誰がいつ考え付いたの？

Laurens van der Maaten & GEoffrey Hinton in 2008. (PDF at Hinton lab)

下の動画では、発案者Laurens van der Maaten氏本人によるt-SNEの解説が見られます。

Visualizing Data Using t-SNE Google Tech Talk　June 24, 2013　(動画55：09）

t-SNEをもう少し詳しく説明すると？

このアルゴリズムの一番の特徴は、 2 点間の「近さ」を確率分布で表現するところにあります。例えば、点 x_i とそれ以外の全ての点との距離を考えましょう。t-SNE では、基準となる点 x_i を中心とした正規分布を考え、距離を測りたい点 x_j が抽出される確率密度を、点 x_i から見た点 x_j の近さ p_{j|i} とします。これにより、x_i の近くにある点ほど p_{j|i} は大きくなり、遠くにある点ほど p_{j|i} は小さくなります。次に、次元圧縮後の点 y_i と点 y_j の「近さ」 q_{j|i} を考えます。これらは、次元圧縮前の点 x_i と点 x_j に対応します。こちらも同様に確率分布で表現するのですが、次元圧縮後の近さは正規分布ではなく自由度 1 の t 分布で考えるところがミソです。(t-SNE を用いた次元圧縮方法のご紹介 ALBERT Official Blog 2015年12月2日)

（上記サイトでは、PCAとt-SNEとを画像データに適用した結果を図示しており、t-SNEのパワフルさが一目でわかります。Rのコードあり。）

次元削減の他の手法PCAなどとはどう違うの？

Most researchers are already familiar with another dimensionality reduction algorithm, Principle Components Analysis (PCA) also available in R2 and explained in more detail in the Principle Components Analysis tutorial. Both PCA and t-SNE reduce the dimension while maintaining the structure of high dimensional data, however, PCA can only capture linear structures. t-SNE on the other hand captures both linear and non-linear relations and preserves local distances in high dimensions while reducing the information to 2 dimensions (an XY plot).　(16. t-SNE: high dimensionality reduction in R2 How to find groups in your dataset using t-SNE. r2-tutorials.readthedocs.io)

そもそもなぜ次元削減をする必要があるの？

Computers have no problem processing that many dimensions. However, we humans are limited to three dimensions. Computers still need us (thankfully), so we often need ways to effectively visualize high-dimensional data before handing it over to the computer. (An illustrated introduction to the t-SNE algorithm By Cyrille Rossant　March 3, 2015)

（上記サイトはヴィジュアルに非常にわかりやすくt-SNEの説明をしています）

遺伝子解析にはなぜPCAよりもt-SNEが適しているの？

First, although PCA minimizes global reconstruction error, it may not preserve local proximities of points. In visualizing gene expression data, we are typically more interested in resolving nearby clusters than in preserving the correct distance relationships between genes with very different patterns of expression. But the optimization criterion of PCA results in the opposite priority: the relationship of distant points is depicted as accurately as possible, while small inter-point distances can be distorted. Second, there may be no single linear projection that gives a good view of the data: in such a case, all linear projection methods will fail. (An intuitive graphical visualization technique for the interrogation of transcriptome data. Bushati et al., 2011. Nucleic Acids Research Volume 39, Issue 17,Pages 7380–7389)

t-SNEの使い方の注意は？

Following are a few common fallacies to avoid while interpreting the results of t-SNE:

1. For the algorithm to execute properly, the perplexity should be smaller than the number of points. Also, the suggested perplexity is in the range of (5 to 50)
2. Sometimes, different runs with same hyper parameters may produce different results.
3. …

(Comprehensive Guide on t-SNE algorithm with implementation in R & Python
SAURABH.JAJU2, JANUARY 22, 2017)

t-SNEの短所は？

t-SNE has three potential weaknesses: (1) it is unclear how t-SNE performs on general dimensionality reduction tasks, (2) the relatively local nature of t-SNE makes it sensitive to the curse of the intrinsic dimensionality of the data, and (3) t-SNE is not guaranteed to converge to a global optimum of its cost function. (Maaten and Hinton, 2008 PDF)

ゲノムデータ（遺伝子発現プロファイルの解析）にt-SNEが使われるようになったのはいつ頃から？

自分が調べた限り、下記の論文よりも古い論文が見つかりませんでした。

Here, we test the recently developed nonlinear dimensionality reduction algorithm, t -statistic Stochastic Neighbor Embedding ( t -SNE) ( 8 ), on a variety of real-world transcriptome data sets. (An intuitive graphical visualization technique for the interrogation of transcriptome data. Nucleic Acids Res. 2011 Sep 1;39(17):7380-9.

We tested seven DRTs applied to four microarray cancer datasets and ran four clustering algorithms using the original and reduced datasets. … On the other hand, t-distributed Stochastic Embedding (t-SNE) and Laplacian Eigenmaps (LE) achieved good results for all datasets. (Comparative study on dimension reduction techniques for cluster analysis of microarray data. Date of Conference: 31 July-5 Aug. 2011 ieeexplore.ieee.org)

どんなデータに使えるの？

Question: why PCA for RNA-Seq but tSNE for scRNA-seq? (biostars.org)

Question: What to use: PCA or tSNE dimension reduction in DESeq2 analysis? (support.bioconductor.org)

t-SNEを実際に使うには？（生物学研究者向け）

Rを用いてt-SNE

A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with Bioconductor (bioconductor.org)

A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data Aaron T.L. Lun, et al. F1000Research Software tool article

The Rtsne module in Array Studio will allow the user to cluster different cells with UMI counts, using the Rtsne package in R (arrayserver.com)

MATLABでt-SNE

t-SNE とは　t-SNE (tsne) は、高次元データの可視化に適している次元削減アルゴリズムです。名前は、t-distributed Stochastic Neighbor Embedding (t 分布型確率的近傍埋め込み) を表します。考え方は、点の間の類似度が反映されるように高次元の点を低次元に埋め込む、というものです。高次元空間の近接点は低次元に埋め込まれた近接点に対応し、高次元空間の遠隔点は低次元に埋め込まれた遠隔点に対応します (一般に、高次元空間と低次元空間で正確に距離を一致させることは不可能です)。関数 tsne は、高次元データから低次元の点の集合を作成します。通常は、低次元の点を可視化して、元の高次元データにおける自然なクラスターを調べます。(Mathworks)

シングルセルRNA-seq解析の実際

Introduction to single-cell RNA-seq (hemberg-lab.github.io)

Seurat is an R package designed for QC, analysis, and exploration of single cell RNA-seq data. Seurat aims to enable users to identify and interpret sources of heterogeneity from single cell transcriptomic measurements, and to integrate diverse types of single cell data. (satijalab.org)

Identifying and Characterizing Subpopulations Using Single Cell RNA-seq Data (hms-dbmi.github.io)

シングルセルRNA-seqガイド

A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications (Haque et al., Genome Med. 2017; 9: 75)

RNA-Seq 実験 sequencing depth の決め方 (bioinformatics 2017.06.10)

Design and Analysis of Single-Cell Sequencing Experiments. Grün et al., 2015 Cell Volume 163, Issue 4, 5 November 2015, Pages 799-810

Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Ziegenhain et al., Molecular Cell 65, 631–643, February 16, 2017 (PDF)

t-SNEを説明した動画(一般）

t-SNE tutorial Part1 Divy Kangeyan 2017/05/26 に公開　（動画12：28）

参考

1. t-SNE explained in plain javascript Nick Strayer· observablehsq.com Feb 6, 2018
2. t-SNEによるイケてる次元圧縮&可視化 Qiita 2017年12月14日に投稿

3. t-SNE(SlideShare)

4. 【多様体学習】LLEとちょっとT-SNE hellocybernetics.tech
5. t-SNEの結果をplotlyで3D可視化する MATHGRAM
6. scikit-learnでt-SNE散布図を描いてみる ももいろテクノロジー
7. https://www.rna-seqblog.com/tag/t-sne/
8. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5845381/
9. http://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1006599

参考（シングルセルRNA SEQデータの解析方法いろいろ）

1. Visualization and analysis of single-cell RNA-seq data by kernel-based similarity learning. Bo Wang, Junjie Zhu, Emma Pierson, Daniele Ramazzotti & Serafim Batzoglou
   Nature Methods volume 14, pages 414–416 (2017) 新手法の提案 We present single-cell interpretation via multikernel learning (SIMLR), an analytic framework and software which learns a similarity measure from single-cell RNA-seq data in order to perform dimension reduction, clustering and visualization. 　既存の手法との比較 On seven published data sets, we benchmark SIMLR against state-of-the-art methods.
2. CIDR: Ultrafast and accurate clustering through imputation for single-cell RNA-seq data. Lin P, Troup M, Ho JW. Genome Biol. 2017 Mar 28;18(1):59. 新手法の提案 Most existing dimensionality reduction and clustering packages for single-cell RNA-seq (scRNA-seq) data deal with dropouts by heavy modeling and computational machinery. Here, we introduce CIDR (Clustering through Imputation and Dimensionality Reduction), an ultrafast algorithm that uses a novel yet very simple implicit imputation approach to alleviate the impact of dropouts in scRNA-seq data in a principled manner. 従来の手法t-SNEなどとの比較 Using a range of simulated and real data, we show that CIDR improves the standard principal component analysis and outperforms the state-of-the-art methods, namely t-SNE, ZIFA, and RaceID, in terms of clustering accuracy. 代表的な結果の図 
3. Visualization and cellular hierarchy inference of single-cell data using SPADE. Anchang B, Hart TD, Bendall SC, Qiu P, Bjornson Z, Linderman M, Nolan GP, Plevritis SK. Nat Protoc. 2016 Jul;11(7):1264-79. 新たなデータ可視化手法の提案 we describe the use of Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events (SPADE), a density-based algorithm for visualizing single-cell data and enabling cellular hierarchy inference among subpopulations of similar cells. 別のデータ可視化手法であるt-SNEとの比較 We compare SPADE with recently developed single-cell visualization approaches based on the t-distribution stochastic neighborhood embedding (t-SNE) algorithm.

参考（t-SNEを用いた論文）

1. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Chen et al., 2017. Cell Reports Volume 18, Issue 13, p3227–3241
2. SAIC: an iterative clustering approach for analysis of single cell RNA-seq data. Yang L, Liu J, Lu Q, Riggs AD, Wu X. BMC Genomics. 2017 Oct 3;18(Suppl 6):689.　解析の重要性 An important step in the single–cell transcriptome analysis is to identify distinct cell groups that have different gene expression patterns. 従来の手法の問題点 Many studies rely on principal component analysis (PCA) with arbitrary parameters to identify the genes that will be used to cluster the single cells. 新手法の提案 We have developed a novel algorithm, called SAIC (Single cell Analysis via Iterative Clustering), that identifies the optimal set of signature genes to separate single cells into distinct groups.　データ可視化のステップでのt-SNEの利用 We applied the SAIC algorithm to one simulated dataset and two published single cell datasets. After signature genes selection, the results were evaluated by Davies-Bouldins index and then visualized using both a t-SNE 2D–plot and an unsupervised hierarchical clustering heatmap.

シングルセル解析二関連する製品（機器、試薬キット、解析ソフトウェアなど）

1. Illumina 1細胞分離からデータ解析まで必要なものが１つにddSEQ™ Single-Cell Isolator とSureCell™ WTA 3′ Library Prep Kit により実現
2. BD Rhapsody シングルセル解析システム　数万のシングルセルに対し数百の遺伝子を同時解析
3. In the study (“Single-Cell RNA-Seq of Rheumatoid Arthritis Synovial Tissue Using Low-Cost Microfluidic Instrumentation”), published in Nature Communications, the researchers describe the 3D-printed custom device, which, along with its electronic and pneumatic components, can be obtained and assembled for a total cost of about $600. The device occupies a small footprint as well, not much larger than a tissue box. (genengnews.com)
4. シングルセル解析は、1細胞レベルでmRNA解析を行うことで、細胞集団の平均的な解析ではなく、個々の細胞の変化を動的に追い、システマチックな理解へ繋げることが可能になる技術です。…　取得した配列データを参照ゲノム配列へマッピングし、適切なソフトウェアを用いて遺伝子発現定量解析を行います。得られた発現プロファイルにアノテーション情報を付与し、各種統計解析を行います。解析結果は、遺伝子の発現量をまとめたファイル、主成分分析（PCA）結果、t-SNE解析などをまとめて納品いたします。（シングルセルレベルでの遺伝子発現解析 ICELL8™ シングルセル解析　takara-bio.co.jp　）

生命科学の他の分野におけるt-SNEの利用

人や動物の行動学の解析においてもt-SNEが用いられています。

1. Comprehensive machine learning analysis of Hydra behavior reveals a stable basal behavioral repertoire. Han et al., 2018. eLife. 2018; 7: e32605.
2. 【行動認識 #9】t-SNEをtensorboard(Embedding Visualization)で可視化 MotoJapan’s Tech-Memo 2017-09-04
3. Automatic classification of behavior in zebrafish larvae. Jouary and Sumbre. bioRxiv May 10,2016
4. Mapping the stereotyped behaviour of freely moving fruit flies. Berman et al., 2014. Journal of the Royal Society Interface

バイオテクノロジーの進歩は、一昔前なら夢物語でしかなかったことを現実にしてくれます。動物の脳の活動をリアルタイムで見せてくれるGCaMPも、そんなテクノロジーのうちのひとつ。GCaMPという名前を聞くのは初めてという人でもGFP (Green Fluorescent Protein)ならどこかで聞いたことがあるのではないでしょうか？GFPは、下村脩博士がオワンクラゲから見つけたもので、タンパク質なのに緑色の蛍光を発するという画期的な性質を持つものです。この研究で下村博士は2008年にノーベル化学賞を受賞しており、GFPは高校の生物の教科書にも紹介されています。このGFPを人工的に改造して、カルシウムイオンが結合するとより明るく光るようしたタンパク質がGCaMPです。つまりGCaMP蛍光強度の変化が、カルシウムイオン濃度の変化に対応するわけです。

GCaMPって誰がいつ発明したの？

2001年に中井淳一博士らのグループにより発明されました(Nakai et al., Nat Biotechnology 2001)。

我々が開発したG-CaMPはGFP1分子とカルモジュリンとミオシン軽鎖キナーゼのM13断片からなる一波長励起一波長測光タイプの蛍光カルシウムプローブである｡GFPと同様のスペクトル特性を持っているので標準的な蛍光顕微鏡やレーザー顕微鏡で容易に観察することができる。G-CaMPの最大の特徴はG-CaMPが蛋白質であるためG-CaMPをコードする遺伝子をプロモーターの制御下に発現させることで,簡単に細胞特異的なプローブの導入ができる点である。(GFPを用いた蛍光カルシウムプローブG-CaMPの開発 中井淳一・大倉正道 比較生理生化学Vol.19,No.2(2002))

GCaMPはカルシウムセンサーとして機能し、カルシウムイオン濃度が高いほど明るい蛍光を発してくれますので、神経細胞に限らず、どんな種類の細胞であれ、細胞内にG-CaMPを導入してやるとその細胞のカルシウムイオン濃度の変化を、G-CaMPの蛍光強度変化として捉えることができます。

GCaMPって何の略？

2001年の原著論文では、green fluorescent protein (GFP)-based Ca2+ probesとしか書いていませんが、

（GCaMPタンパク質の立体構造。左側は横から見た図で、右側は縦方向から見た図。Akerboom et al., 2013 Fig.3を改変）

カルモジュリン(Calmodulin)はCaMと表記されますので、GはGFPのG,CaMはカルモジュリンのCaM、PはProteinのPでしょうか。

Green fluorescent protein – calmodulin protein – (GCaMP)-type GECI are based on a circularly permutated EGFP molecule (cpEGFP) flanked at the N and C termini by the smooth muscle myosin light chain kinase derived calmodulin binding peptide (RS20) and calmodulin (CaM), respectively. (Helassa et al., Scientific Reports volume 5, Article number: 15978 (2015))

In our laboratory, we have focused our efforts to improve genetically encoded calcium indicator proteins (GECIs), specifically the green fluorescent protein (GFP)-Calmodulin fusion protein (GCaMP).(Badura et al., 2014 doi: 10.1117/1.NPh.1.2.025008)

G-CaMPそれともGCaMP？

２つの単語をハイフンでつないで１語にしていたものが、一般的になるにつれてハイフンがとれて完全な一語になるということが起こります。G-CaMPもそうやってGCaMPになったのかと思いきや、どうやらそう単純ではないようです。発明者である中井博士らのグループは今日に至るまでG-CaMPと表記しており、G-CaMPの改良型を作製し発表した他のグループはGCaMPと表記しています。あまり気にしていない論文も見受けられます。特定のGCaMPについて言及する際には、そのGCaMPを報告した論文内でどう表記されているかに気を配る必要があるでしょう。

Here we report the development of a high-affinity Ca(2+) probe composed of a single GFP (named G-CaMP). (Nakai et al., Nat Biotechnol. 2001 Feb;19(2):137-41.)

Generation and Imaging of Transgenic Mice that Express G-CaMP7 under a Tetracycline Response Element. (Sato et al., 2015 PLoS One 10(5):e0125354)

歴史的にも多少ややこしいことになっています。G-CaMPの改良型を報告した2006年の論文には中井博士らも共著者として入っていますが、ここではGCaMP2と命名されており、オリジナルのG-CaMPのことをGCaMP1としています。

Designed and random alterations in the previously described, circularly permutated eGFP-based, Ca2+-sensing molecule, which we now term GCaMP1 (11), were undertaken to improve brightness and stability. (Imaging cellular signals in the heart in vivo: Cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Yvonne N. Tallini, Masamichi Ohkura, Bum-Rak Choi, Guangju Ji, Keiji Imoto, Robert Doran, Jane Lee, Patricia Plan, Jason Wilson, Hong-Bo Xin, Atsushi Sanbe, James Gulick, John Mathai, Jeffrey Robbins, Guy Salama, Junichi Nakai, and Michael I. Kotlikoff. PNAS March 21, 2006. 103 (12) 4753-4758)

Howard Hughes Medical Institute/Janelia Research Campusの研究者らはGCaMPとハイフンを入れない表記をしています。

Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Tian L, Hires SA, Mao T, Huber D, Chiappe ME, Chalasani SH, Petreanu L, Akerboom J, McKinney SA, Schreiter ER, Bargmann CI, Jayaraman V, Svoboda K, Looger LL. Nat Methods. 2009 Dec;6(12):875-81.

そんなわけで、G-CaMPとGCaMPの両方の表記が世の中で見られます。

GCaMPで何が見えるの？

細胞の中に導入されたGCaMPは、細胞内カルシウムイオン濃度をモニターして可視化してくれますので、カルシウムイオンの濃度変化が生じるような生命現象なら何でも可視化することができます。そのような生命現象としては受精、細胞分裂、細胞の分化、細胞の移動、筋収縮、神経細胞の興奮などいろいろあります。

下の動画はショウジョウバエの排卵のときに卵母細胞内のカルシウム濃度が上昇する様子（排卵時のカルシウム動態は14秒あたりから）。

PNAS : Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate

（In vivo imaging at dissection scope resolution of Ca2+ flux in activating oocytes from transgenic flies expressing GCaMP3 in their oocytes. See text and the legend to Fig. 1A for details.　論文　https://doi.org/10.1073/pnas.1420589112）

下の動画は、線虫(C. elegans)という小さな小さなミミズみたいな生き物が動いている様子ですが、筋肉の細胞にGCaMPが導入されているため、筋収縮が起きているところが明るく光ります（擬似カラー表示されていて、暖色系の明るい色がカルシウム濃度の高い部分）。体が屈曲しているときに曲がりの内側部分のほうが明るくなる、つまり筋肉が収縮していることがわかります。

Ca2+ dynamics in body wall muscles of wild-type C. elegans

（Genetic crosses were made to transfer the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3.35 (Schwarz et al., 2011) into the vps-36 (gk427) background.　論文リンク　http://jcs.biologists.org/content/129/7/1490）

下の動画の実験では、視覚を司る脳部位の神経細胞にGCaMPが導入されており、熱帯魚の一種ゼブラフィッシュ（ペットショップでの名前はゼブラダニオ）の稚魚が餌となるゾウリムシを見ているときに脳が活動している様子を見せてくれます。

Neuronal Activity during Visual Perception 脳に映る視覚世界をリアルタイムで観察

(The gSA2AzGFF49A;UAS:GCaMP7a double-transgenic zebrafish used for imaging were also homozygous for the nacre pigmentation mutation [24] to eliminate melanophores. 論文リンク　https://doi.org/10.1016/j.cub.2012.12.040）

下の画像は新世界ザルの一種コモン・マーモセットが左手や左足を触られたときの脳（右側の体性感覚野）の活動の様子。動画は画像をクリックしてリンク先でご覧ください。

（Here, we report a method for long-term imaging of a GECI, GCaMP6f, expressed from adeno-associated virus vectors in cortical neurons of the adult common marmoset (Callithrix jacchus), a small New World primate.　論文リンク　https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.10.050）

GCaMPってどれがいいの？

研究者がこれからカルシウムイメージングをしてみたいという場合には、どのカルシウムプローブを選ぶかは重大な決断となります。G-CaMP(GCaMP)の場合、2001年の最初の報告以来、改良に改良が重ねられてきて、しかも発明者らを含む複数のラボが独立して改良に取り組んだため、改良型GCaMPの名前が必ずしも統一的になっておらず、かなり混乱させられる状況です。同じラボで開発されたものであればバージョンの数字が大きいほど一般的に性能が良い（シグナルノイズ比が良い、微弱なカルシウムイオン濃度の変化を検出可能）と言えるのでしょう。ただし理屈を言えば、見たい生理現象で変化するカルシウムイオン濃度の範囲がどのあたりかに合わせて、その範囲でシグナル強度がもっとも大きく変化するような解離定数を持つGCaMPを選ぶ必要があります。また、カルシウムシグナルの時間変化が速い現象を高い時間分解能で検出したいのであれば、GCaMPとカルシウムイオンが一度結合したあとに速やかに離れるようなものを選ぶ必要があります。シグナル（蛍光強度変化）を大きくするために、低カルシウム濃度における蛍光強度を弱く抑えた設計になっているものでは、カルシウムイオンが増加しない限り細胞がGCaMPの蛍光では見えにくく、実際には使いづらいという状況も有り得ます。結局のところ、どのGCaMPがベストかは、見たい生命現象、実験目的、実験のデザインによって変わってくると言えそうです。

jGCaMP7シリーズ　（ジャネリア・ファーム）

ジャネリア・ファームの研究グループが新たにjGCaMP7のシリーズを開発し、論文発表前ですが既に塩基配列を公開しています。

(引用元：https://www.janelia.org/project-team/genie)

追記：論文のプレプリントが2018年10月3日にbioRxiveに投稿されていました。

High-performance GFP-based calcium indicators for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Hod Dana, Yi Sun, Boaz Mohar, Brad Hulse, Jeremy P Hasseman, Getahun Tsegaye, Arthur Tsang, Allan Wong, Ronak Patel, John J Macklin, Yang Chen, Arthur Konnerth, Vivek Jayaraman, Loren L Looger, Eric R Schreiter, Karel Svoboda, Douglas S Kim https://www.biorxiv.org/content/early/2018/10/03/434589

GCaMP6シリーズ (GCaMP6s, GCaMP6f, GCaMP6m)　（ジャネリア・ファーム）

個々のGCaMP6の名前の最後に付いているアルファベットs, f, mは、キネティクスの速さがそれぞれスロー、ファースト、メディウムであることを示しています。

Using structure-based mutagenesis and neuron-based screening, we developed a family of ultrasensitive protein calcium sensors (GCaMP6) that outperformed other sensors in cultured neurons and in zebrafish, flies and mice in vivo.

Based on screening in cultured neurons (Fig. 1), we chose three ultrasensitive GCaMP6 sensors (GCaMP6s, 6m, 6f; for slow, medium and fast kinetics, respectively) for characterization in vivo. These sensors vary in kinetics, with the more sensitive sensors having slower kinetics. (Chen et al., 2013 Nature 499, 295-300)

G-CaMP6, G-CaMP7, G-CaMP8およびそのヴァリアント　(中井博士らのグループ）

The dynamic range of G-CaMP7 (Fmax/Fmin = 36.6±4.10, n = 3) was ∼3-fold greater than that of G-CaMP6, even though this variant showed a lower Ca2+ affinity (Kd = 243±14 nM, n = 3) than G-CaMP6 (Fig. 1B and C). By performing further random mutagenesis on G-CaMP7, we obtained a more sensitive variant of G-CaMP7 termed G-CaMP8,  (Ohkura et al., 2012 PLOS ONE https://doi.org/10.1371/journal.pone.0051286)

we introduced amino acid substitutions into GCaMP-HS, tested their activities, and developed a new version, which we named GCaMP7a (Muto, Ohkura et al., 2013. Curr Biol. 23(4):307-311)

Caプローブのさらなる改良

1. 脳情報動態の多色HiFi記録を実現する超高感度カルシウムセンサーXCaMPを開発－東大 （2019年05月14日　PM12:00　医療NEWS）従来のGECIはHill係数が2～3付近であることから、複数の発火に対し非線形的に蛍光強度が変化し、かつ、広範囲のCa2+濃度を検出するのが困難だった。そこで研究グループは、これらの問題を解決するために、超高速、高感度、Hill係数1かつダイナミックレンジが大きい多色GECIを作成することを目指した。

Calcium Imaging Gets a Multicolor Makeover / Cell, May 9, 2019 (Vol. 177, Issue 5) 2019/05/10 Cell Press

参考

ブログ

1. GCaMP7（A317Lとは？） jGCaMP7 cultured neuron data (Mのメモ 2018-02-14) 

参考論文（【開発元とGCaMPのバージョン】）

1. 【ジャネリア　jGCaMP7シリーズ】jGCaMP7 (addgene.com)　（論文未発表）
2. 【ジャネリア　GCaMP6シリーズ】Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Chen et al.,2013. Nature 499:295–300. “we developed a family of ultrasensitive protein calcium sensors (GCaMP6) that outperformed other sensors in cultured neurons and in zebrafish, flies and mice in vivo.”  “Based on screening in cultured neurons (Fig. 1), we chose three ultrasensitive GCaMP6 sensors (GCaMP6s, 6m, 6f; for slow, medium and fast kinetics, respectively) for characterization in vivo.”
3. 【中井博士ら　GCaMP7a】Real-Time Visualization of Neuronal Activity during Perception. Muto, Ohkura et al., 2013.Curr Biol. 23(4):307-311. “we introduced amino acid substitutions into GCaMP-HS, tested their activities, and developed a new version, which we named GCaMP7a”
4. 【中井博士ら　G-CaMP6, G-CaMP7, G-CaMP8】Genetically Encoded Green Fluorescent Ca2+ Indicators with Improved Detectability for Neuronal Ca2+ Signals. Ohkura et al., 2012. PLOS ONE 7(12): e51286.  “As expected, G-CaMP6, a variant of G-CaMP5.09 bearing an M36L substitution in the CaM domain (Fig. 1A), showed a higher Ca2+ affinity (Kd = 158±4.0 nM, n = 3) than G-CaMP5.09 or the previously reported G-CaMP2 variants G-CaMP-HS [17] and G-CaMP3 [4] (Fig. 1B and C).” ” Next we performed random mutagenesis on G-CaMP6 by using an error-prone PCR [15] and were able to screen a highly responsive variant termed G-CaMP7, which differs from G-CaMP6 by a deletion of histidine (ΔH) in the RSET domain and an S205N mutation in the circularly permutated EGFP domain (Fig. 1A). The dynamic range of G-CaMP7 (Fmax/Fmin = 36.6±4.10, n = 3) was ∼3-fold greater than that of G-CaMP6, even though this variant showed a lower Ca2+ affinity (Kd = 243±14 nM, n = 3) than G-CaMP6 (Fig. 1B and C). By performing further random mutagenesis on G-CaMP7, we obtained a more sensitive variant of G-CaMP7 termed G-CaMP8,”
5. 【ジャネリア　GCaMP5シリーズ】Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. Akerboom et al., 2012.J Neurosci 32 (40) 13819-13840 “Through protein structure determination, targeted mutagenesis, high-throughput screening, and a battery of in vitro assays, we have increased the dynamic range of GCaMP3 by severalfold, creating a family of “GCaMP5” sensors.” “Consequently, the Asp380Tyr mutation raises the brightness of the calcium-bound state of GCaMP3 for both GCaMP5A and GCaMP5G; in addition, calcium affinity and cooperativity (Hill coefficient) are increased by ∼25% for GCaMP5A (Table 1).”
6. 【中井博士ら　G-CaMP 4.1】Tissue-Tissue Interaction-Triggered Calcium Elevation Is Required for Cell Polarization during Xenopus Gastrulation. Shindo et al., 2010. PLoS ONE 5(2): e8897. “G-CaMP 4.1, which is an improved form of a previously reported calcium indicator,”
7. 【中井博士ら　GCaMP-HS】Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Muto, Ohkura et al., 2011. PNAS 108 (13) 5425-5430. “we developed GCaMP-HS (GCaMP-hyper sensitive), an improved version of the genetically encoded calcium indicator GCaMP,” “Kd and Hill coefficient of GCaMP-HS were 102 nM and 5.0, respectively (Fig. 1D). Kd and Hill coefficient of GCaMP2 were 146 nM and 3.8, respectively, indicating that GCaMP-HS has a higher affinity to Ca2+ ions and a higher cooperativity”
8. 【ジャネリア　GCaMP3】Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Tian et al., 2009. Nat Methods. 6(12):875-81.”We developed a single-wavelength GCaMP2-based GECI (GCaMP3), with increased baseline fluorescence (3-fold), increased dynamic range (3-fold) and higher affinity for calcium (1.3-fold). We detected GCaMP3 fluorescence changes triggered by single action potentials”
9. 【ジャネリア　GCaMP2結晶構造解析】Crystal Structures of the GCaMP Calcium Sensor Reveal the Mechanism of Fluorescence Signal Change and Aid Rational Design. Akerboom et al., 2009. J Biol Chem. 284, 6455-6464
10. 【ジャネリア＆中井博士ら　GCaMP2】Imaging cellular signals in the heart in vivo: Cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2.
    Tallini, Ohkura, et al., 2006. PNAS 103 (12) 4753-4758. “previously described sensors have proved to be of limited use to report cell signaling in vivo in mammals. Here, we describe an improved Ca2+ sensor, GCaMP2,”
11. 【中井博士ら　元祖G-CaMP】A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nakai et al., 2001. Nat Biotech. 19:137–141.

科学の本質

ミステリーボックスを生徒に見せると、「中身を見せて」と言われますが、絶対に見せません。科学と同じく、ミステリーボックスは「答え」が問題ではないのです。普遍的な真理を得ることは不可能です。疑問を持つことしかできないのです。生徒には、家に帰ったら自分でミステリーボックスを作ってごらん、もし同じように動作をするものが作れたら、成功ということだよ、と言います。しかし、自分のミステリーボックスの中身を見せてあげることは決してしません。これこそが科学のデモンストレーションですよね。

(7:15-) Now, when I show my students the mystery box, they say now show us what’s inside. But, I will never do that. Of course, it’s sealed. Just like science, the mystery box isn’t about the answer. We don’t have access to some sort of universal truth. All we have are the questions. I tell the students, they can go home and make their own mystery box. And, you can do that, too. And, if your mystery box works the same as mine, congratulations, you are successful. But I will never show you the inside of my mystery box. That’s the science demonstration, right?

Teaching science: we’re doing it wrong | Danny Doucette | TEDxRiga

セレンディピティ

現代はある意味でカンニングに近い社会である。情報が溢れ過ぎており、また、便利になり過ぎている。何でも教えてもらえるので、自分自身でとことん考えたり、本当に自力で見つける機会がほとんど無くなっている。‥　発見に値することは、目の前にいくらでもあるのだ。それを見抜く目があるかどうかが真の問題なのである。その目を確実に育てることこそ創造性教育の原点である。（創造性教育とセレンディピティ　先端科学技術と教育問題　日立製作所、科学技術振興機構研究統括　小泉英明　『危機に立つ日本の理数教育』明石書店　2005年　15~16ページ）

参考

1. http://tedxriga.com/teaching-science-wrong/
2. 板倉 聖宣『科学的とはどういうことか』仮説社 1977年

一昔前までは、DNAコンストラクションと言えば、同じ制限酵素で切断したDNA断片（あるいは異なる制限酵素であっても切り口が同一の断片）を、DNAリガーゼで結合させるというのが一般的でした。そのため、DNAコンストラクションを考えるときには、どんな制限酵素が使えるかというのは大問題だったわけです。しかし、テクノロジーの進歩により時代はすっかり様変わりしました。ギブソンアセンブリー(Gibson Assembly (Gibson et al., 2009 Nat Methods))、NEBuilder、 In-Fusion, GeneArtなど、短いホモロジーをもつDNA断片をひとつにする方法が相次いで開発され、手軽に使えるキットが市場に出回った結果、DNAのコンストラクトを作成するときに制限酵素サイトが不要になったからです。

今となっては、DNAコンストラクションを行うための適当な制限酵素サイトで知恵を絞るのは、自分が昔学んだやり方にこだわり続ける、一部の高齢の研究者だけなのでしょうか。

最先端の研究を行うためには新しいテクノロジーをいち早く自分の研究に取り入れる必要があるわけですが、その一方で、研究者というのは、ある部分非常に保守的で、自分が過去にうまくいったやり方に固執してしまうものです。たとえそれがすっかり時代遅れなものになっていたとしても。

ギブソンアセンブリー

各メーカーからいくつかのキットが発売されており、一般的に使われていますが、制限酵素サイトで悩む必要がないということをわかりやすく伝える動画（2010年）をまずは見てみましょう。ギブソンアセンブリー(Gibson Assembly) の原理が歌に乗せて説明されています。

The Gibson Assembly Song

Gibson Assembly システム (ギブソン・アッセンブリー・システム)

1. 末端に15塩基の相同配列があるDNA断片とGibson Assemblyマスターミックスを混合し、15-60分間インキュベーションするだけ
2. 複数断片を一括してクローニングすることが可能
3. 10kbのインサートでも94%の高いクローニング効率
   （引用元：NEB　https://www.nebj.jp/f/541）

We describe an isothermal, single-reaction method for assembling multiple overlapping DNA molecules by the concerted action of a 5′ exonuclease, a DNA polymerase and a DNA ligase. First we recessed DNA fragments, yielding single-stranded DNA overhangs that specifically annealed, and then covalently joined them. This assembly method can be used to seamlessly construct synthetic and natural genes, genetic pathways and entire genomes, and could be a useful molecular engineering tool. (Gibson et al., Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods volume 6, pages 343–345 (2009) doi:10.1038/nmeth.1318)

1. NEW ENGLAND BioLabs (NEB)　製品情報　Gibson Assembly Master Mix　カタログ番号:E2611S 、サイズ:10 reactions、価格:¥18,000
2. Gibbson Assembly (NEB)
3. Daniel G Gibson, Lei Young, Ray-Yuan Chuang, J Craig Venter, Clyde A Hutchison III & Hamilton O Smith. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods volume 6, pages 343–345 (2009) doi:10.1038/nmeth.1318
4. I’m having a lot of troubles with this reaction. Supposedly, it’s pretty quick and easy… but I’ve been working in this construction for months. (Asked 5 years ago
   Gabriela Chavez-Calvillo, ResearchGate)
5. I recently Gibsoned a 9kb insert into a 5kb vector at a 1:1 molar ratio.(Christopher Duran, Colorado State University, 5 years ago ResearchGate)
6. Gibson Assembly – Science topic ResearchGate

NEBuilder HiFi DNA アッセンブリー

Gibson AssemblyのキットはNEBから発売されていますが、NEBは今は同様の原理に基づく「NEBuilder HiFi DNA アッセンブリー」という製品を推奨しているようです。

NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit

1. Gibson Assemblyより正確かつ高効率
2. 末端に 15 塩基の相同配列がある DNA 断片とマスターミックスを混合し、15 – 60 分間インキュベーションするだけ
   （引用元：NEB　https://www.nebj.jp/products/detail/1941）

1. NEW ENGLAND BioLabs (NEB)　製品情報　NEBuilder HiFi DNA アッセンブリー　製品名：NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix, 製品番号：E2621S, 容量：10 reactions, 希望小売価格：￥18,000
2. Gibson Assembly® Cloning Kit: Have you tried NEBuilder HiFi DNA Assembly? NEBuilder HiFi offers several advantages over NEB Gibson Assembly. For more information, visit NEBuilderHiFi.com.
3. NEBuilder® HiFi DNA Assembly (New England BIoLabs; NEB)
4. Introduction to NEBuilder HiFi DNA Assembly

In-Fusion

NEBのギブソンアセンブリーと並んで、人気を二分するのが、クローンテックのIn-Fusion（販売：Takara)。

an In-Fusion™ enzyme reaction can join any two pieces of DNA that have 15 bp of identity at their ends. … The In-Fusion mechanism is ligation-independent and while proprietary, likely uses the unique properties of the 3′–5′ exonuclease activity of poxvirus DNA polymerase. When incubated with linear duplex DNAs with homologous ends in the presence of Mg²⁺ and low concentrations of dNTP, the 3′–5′ proofreading activity of poxvirus DNA polymerase progressively removes nucleotides from the 3′ end. This exposes complementary regions on substrate DNAs that can then spontaneously anneal through base pairing, resulting in joined molecules containing a hybrid region flanked by nicks, 1–5 nucleotide gaps, or short overhangs. The annealed structures are metastable because the poxvirus DNA polymerase has a lower affinity for nicked or gapped DNA ends than for duplex ends. Introduction into Escherichia coli repairs any single-stranded gaps. (Zhu et al., BioTechniques, Vol. 43, No. 3, September 2007, pp. 354–359)

1. In-Fusion® HD Cloning Kit (Clontech / Takara) （商品と価格の一覧、製品説明など）
2. In-Fusionクローニングのススメ 2nd Edition (タカラバイオ PDF) 多くのユーザー様にご愛用いただいているIn-Fusion®ですが、知ってるけれど使ったことはないという方も
3. すでにIn-Fusionをお使いのユーザー様からお寄せいただいた「使ってよかった！」のユーザーズボイスをご紹介(Takara)
4. Design Genes with Ease Using In-Fusion Cloning (Clontech)

GeneArt DNA Assembly

GeneArt® DNA Assembly – Meet the Inventor Series

1. GeneArt® シームレスクローニングおよびアセンブリキット (ThermoFisher SCIENTIFIC) 製品番号(カタログ番号) :A13288, 容量:20 reactions,標準価格: (JPY)54,600

SLiCE

we developed a new restriction site independent cloning method that does not leave any unwanted sequences at the junction sites (seamless) and is based on in vitro recombination between short regions of homologies (15–52 bp) in bacterial cell extracts termed SLiCE (Seamless Ligation Cloning Extract). (Zhang, Werling and Edelmann. Nucleic Acids Res. 2012 Apr; 40(8): e55. Published online 2012 Jan 11. doi: 10.1093/nar/gkr1288)

1. SLiCE from Escherichia coli laboratory strains（本橋研究室）：seamless cloningに関連する試薬は、Gibson assembly kitやIn-Fusion kitなどの名称で様々なメーカーから商品化されていますが、その多くが高価で、資金の乏しい研究室では購入を躊躇しているかもしれません。そのような方に、ぜひ試していただきたいのがこのSLiCE法です。

iVEC

iVEC大腸菌株（AQ3625株）は、PCR増幅した挿入DNA断片とベクターDNAを同時にトランスフォームするだけでシームレスクローニングができるという大腸菌株です。ナショナルバイオリソース – 大腸菌(仁木研)(Facebook 太字強調は当サイト)

Cold Fusion

Homologous DNA ends are efficiently fused together and produce vector clones with great accuracy. (Cold Fusion Cloning Kit with Competent Cells. How It Works. SBI System Biosciences))

1. フナコシ試薬商品紹介サイト　メーカー :SBI 商品コード:MC010A-1 商品名:Cold Fusion Cloning Kit (10reactions) 包装:1kit 価格：\44,000

で、結局、どのキットがいいの？

似たような原理にもとづいて同じことができるキットが複数のメーカーから発売されているため、どれが一番いいの？という疑問が生じます。同じラボ内でも研究者ごとに選択肢が異なっていたりもしますので、実験目的、好み、最初にうまくいったからといった理由で決まるのかもしれません。

ちなみに自分はIn-Fusionしか使った経験がありません。知り合いが使っていて、初めて知ったのがたまたまIn-Fusionだったからというだけの理由です。ラボ内の同僚は違うキットを愛用しているようです。

ギブソンアッセンブリー、In fusion、Gene artなど制限酵素処理なしで相同配列を利用してDNAを繋げる方法でPCR産物をベクターにクローニングする場合、試薬会社から購入できるものの中で使用感が良いものはどれでしょうか？（BioTechnicalフォーラム　2015/12/02）

1) gibson leaves no nick on the product, while infusion does.
2) gibson is more robust, it tolerate 3´- & 5´-end mismatch, while infusion doesn’t. … most false positive colonies i got when using gibson were actually caused by primer dimer or unspecific pcr products (they have the same overlap ends as the designed products)
3) there is ligase in gibson. so if you use only one restriction enzyme to linearize your plasmid backbone and use it in the assembly. The ligase may repair the backbone back to empty plasmid.

(Xinglin Jiang, Technical University of Denmark. What‘s the differences between the gibson assembly(NEB) and in-fusion clone(clontech)? ResearchGate)

A major limitation to SLIC/Gibson/CPEC/SLiCE assembly is that the termini of the DNA sequence fragments to be assembled should not have stable single stranded DNA secondary structure, such as a hairpin or a stem loop (as might be anticipated to occur within a terminator sequence), as this would directly compete with the required single-stranded annealing/priming of neighboring assembly fragments. (The SLIC, Gibson, CPEC and SLiCE assembly methods (and GeneArt® Seamless, In-Fusion® Cloning. j5.jbei.org)

節約法

高い試薬キットを使うときに、メーカーによって推奨される容量よりもスケールダウンすることにより使用量を節約して、使う回数を増やすということがラボではよく行なわれています。（＊自己責任で）

@3Mousquetaire @timasaki @genta_micin in-fusion は1/10スケールで、Gibsonは1/5スケールで。OK

— Tea (@tea_gondii) 2014年10月11日

まだ制限酵素使ってんの？

今の状況がわかるツイートを紹介。

そして「Gibson Assemblyが一般的となった今、もう制限酵素を使ってクローニングしているラボなんて、世界中どこを探してもないだろう」と同僚が説明していて、いやまだ使ってるところ絶対あるよ！たぶん結構あるよ！と思ったのは内緒。

— Hiroshi Sasaki (@popeetheclown) 2017年8月10日

制限酵素を使わずにDNAコンストラクトを作成する時代

時代がすっかり変わったねという認識を促すレビュー記事をいくつか紹介。

Over the past decade, scientists have developed and fine tuned many different ways to clone DNA fragments which have provided appealing alternatives to restriction enzyme cloning. These newer technologies have become more and more common, and for good reason. They offer many advantages over the traditional restriction enzyme cloning we once relied exclusively on. (Addgene’s Blog. Posted by Brook Pyhtila on Mar 1, 2016 太字強調当サイト)

It’s been more than four decades since researchers launched the molecular-biology revolution with the invention of DNA cloning. In that time, the tools of the trade have changed relatively little, and for many researchers, DNA cloning still means restriction enzyme digestion and DNA ligation. … Today, thanks largely to the needs and creativity of the synthetic-biology community, alternative, “seamless” cloning strategies have been developed. Here are some of the more popular options. (Say Goodbye to Genetic Scars with These Seamless Cloning Kits
Posted: May 29, 2014 Jeffrey M. Perkel 太字強調は当サイト)

参考

1. Gap-Repair Cloning：GRCがinvitrogenからkit化されて発売されています。GeneArt?® Seamless Cloning & Assemblyという名前です。酵母のコンピテントセルやトランスフォーメーション試薬、大腸菌のコンピテントセル等もすべて含まれたキットです HM’s Home page
2. 相同組換え方法およびクローニング方法並びにキット Inventor　正治 磯部　信幸 黒澤　Original Assignee　国立大学法人富山大学　Priority date　2008-03-07
3. Homologous recombination-based DNA cloning compositions. US8501454B2 Inventor:Weiqiang Liu, Ping Yang, Tao Wang, Zhuying Wang, Wenzhu Chen, Fang Liang Zhang, Original Assignee:Nanjingjinsirui Science and Tech Biology Corp, Priority date 2008-09-10
4. Cloning Without Restriction (TheScientist September 12, 2005) Key to Invitrogen’s Gateway technology is the “entry clone,” which contains a fragment of interest in a recombinase-ready plasmid. Researchers can quickly and efficiently move between expression systems without subcloning by swapping the insert from vector to vector.
5. 2003-08-28 US20030162265A1
6. まだ東京で消耗してるの? 　イケダハヤト著　幻冬舎　2016年