ウエスタンブロッティングは生物系の研究においては非常にポピュラーな実験で、目的とするタンパク質が試料中に存在することを確認するものです。自分も大学院に入ってすぐにやった実験の一つです。ウェスタンは生物系の実験としては極めてありふれたものなのですが、だからといって簡単に誰もが上手くできるものではありません。実験が下手な人のウェスタンと実験が上手い人のウェスタンの結果には、雲泥の差があります。

ウエスタンブロッティングとは

ウエスタンブロッティング(Western blotting)(ウエスタンブロット法(Western blot analysis)とも呼ばれる）は、タンパク質のサンプルをSDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後(SDS-PAGE;SDS Polyacrylamide gel electrophoresis)、ゲル内で分子量に応じて分けられたタンパク質をメンブレンにブロットし（電圧をかけてタンパク質をゲルから出てこさせて、ゲルに密着させたメンブレン上に吸着させる）、その後、メンブレン上のタンパク質を特定の抗体を用いて検出する解析手段です。試料の中に、目的とするタンパク質が存在するかどうかを調べる目的で行われます。ラボ内の会話では、ウエスタンブロット、あるいは単にウエスタンと呼ばれることが多いです。また、イムノブロット(immunoblot)と呼ばれることもあります。

なけなしのお金で買った86,000円の抗体でウェスタンのバンドが出ないリアル世界の現状と比べると、ツイッタランドのカオスなど「大変」の範疇に入りません。

— えすえすマフラー作戰 (@ssmufler) September 4, 2015

 

ウエスタンの名前の由来・命名した人

ウエスタンブロットのウェスタンという名前はどこから来たのでしょうか。これは非常に有名な話なので、ラボに入った学生は先輩から最初に聞く小話だと思います。エドウィン・サザン（Sir Edwin Mellor Southern)という人が、DNAをゲル電気泳動で分離してからメンブレンにブロットし、特定のDNAを検出する実験法を考案して、それがサザンブロットと名付けられました。DNAが南なら、RNAは北で、タンパク質は西となったのです。

With due respect to Southern (l), the established tradition of “geographic” naming of trans-fer techniques (“Southern,” “Northern”) is continued; the method described in this manuscript is referred to as “Western” blotting.　(W.NealBurnette Analytical Biochemistry, April 1981;112(2):195-203)

東と西がまだ空いていたのになぜ西になったのかというと、ウェスタンブロット法を編み出したBurnetteが当時いたNowinski ラボはFred Hutchinson Cancer Research Center内にあり、その場所はワシントン州の都市シアトル、つまり西海岸にある都市だったからだそうです。

DNA blotting was called Southern blotting after its inventor, Edwin Southern at Oxford University. RNA blotting, developed in 1977, was called “Northern blotting” by James Alwine, David Kemp and George Stark at Stanford University as a play on Southern blotting. During a quick chat, Nowinski and Burnette decided to continue the directional joke. They dubbed Burnette’s method “Western blotting” simply because the laboratory was located on the West Coast. (The man behind the Western blot: W. Neal Burnette ASBMBTODAY)

東だけは対応する実験がありません。ないというよりも、いろいろな研究者が自分がコレと思う実験手法をEastern blottingと名付けたために混乱を招き、どれも一般には受け入れられないまま今日に至るのだと思います（ウィキペディア参照）。

1. Eastern blot (Wikipedia)
2. The Early Days of Blotting Edwin Southern

 

Western blottingのWは小文字にすべき？

サザンブロッティングのサザンは人の名前なのでSouthernとSは大文字ですが、他は方角の名前由来なので、文中では大文字にしないのが正しいという意見があります。

Southern blotのSouthernは人の名前だから大文字で、western blotとnorthern blotはその派生だから小文字が厳密には正しいって最高に紛らわしい

— (@_alwayswonderin) March 2, 2021

そうはいっても、自分もそんなことは今の今まで知りませんでした。聞いて忘れただけかもですが。

ご協力ありがとうございます。
そこそこ多くの人が、間違っちゃってますね。もちろん座学で1度は習ってるはずのSouthern、northern、westernができた歴史。忘れちゃったり、大文字小文字のルールと結びつかなかったり。私も今まで間違って全部大文字にしちゃってたよ。 https://t.co/6sy5mdimZ4

— 山田かおり PhD (@KaoriYamada01) January 18, 2022

ランダムに文献を見てみると、

, and Western blotting also identifies HDAC3 as the preferred cellular target of the inhibitor. (Cell Chemical Biology10.1016/j.chembiol.2009.07.010)

as shown by Western blotting and immunoprecipitation using Xenopus anti-B-type cyclin antibodies. (Cell 10.1016/0092-8674(90)90599-A

was incubated with 10 μL RBD-beads overnight, followed by western blotting. (Cell10.1016/j.cell.2021.03.031)

followed by immunoprecipitation and western blot analyses. (PLOS Biology10.1371/journal.pbio.3001113)

確かにちゃんと小文字で書いている論文もあります。これに関してはツイッターでアンケート調査がありましたので紹介。

論文でwestern blottingについて言及する時は

— 山田かおり PhD (@KaoriYamada01) January 18, 2022

しかし研究者の中には大文字派と小文字派がいて、雑誌のエディターが気にしないのであれば、無理にどちらが正しいか決めないほうが平和だと思います。

There are people who strongly believe that we should always write Western blot, and there are also people who strongly believe that the term should be written as western blot except at the beginning of a sentence.

Journals don’t specify how you should write this in their author guidelines. I browsed some recent papers in a few journals:Nature Communications,Scientific Reports,Science Advances, andPLOS Biology. They have all published papers where authors write Western blot and those where authors write western blot. So either way is allowed by journals.

(The funny thing about writing the term western blot letpub.com) *太字強調は当サイト

私は個人的には、ウェスタンやノーザンも大文字で書くことのほうが理にかなっているように思います。ウェスタンブロッティングのウェスタンに、実験内容を反映するような「西」の意味はないので、サザンに合わせるほうが一貫性があって良いと思うからです。下の意見に賛成。

Because Southern is capitalized, some people argue that western blot should follow the same convention, so western should always be capitalized. If not, the word western means a geographic direction, which would not make sense here. (The funny thing about writing the term western blot letpub.com)　＊太字強調は当サイト

命名した本人（W.NealBurnette）は、その論文( Analytical Biochemistry, April 1981;112(2):195-203)でどう表記しているかというと、

• Compared to the electrophoretic transfer of proteins to DBM paper, Western blotting with unmodified nitrocellulose gives markedly better resolution, is significantly easier to perform, and does not re-quire preequilibration of the gel nor diazoti-zation of the nitrocellulose (R. Eisenman and W. Mason, personal communication).
• It must be emphasized that sensitivity in Western blotting is primarily a function of the specific antibody titer of the immune serum being utilized.
• A disadvantage of the Western blot from SDS-gels is the tendency of antigenically reactive sites (epitopes) on the fractionated molecules to be irreversibly denatured by the detergent (26,27).
• Therefore, when selecting monoclonal antibodies for use in Western blotting analysis it is necessary to test the SDS sensitivity of the specific epi-topes.
• Unlike blotting to diazotized paper (1,2,6), the radiolabeled probes of Western blotting are not readily removed from non-derivatized nitrocellulose for reuse of the replicas with different probes.
• The technique of Western blotting should prove valuable for the analysis of proteins fractionated on the basis of molecular weight in SDS gel electrophoresis.
• Coupled with antigen de-tection by antibody and IPA, the Western blot is a very sensitive method for visualizing specific proteins in complex antigenic mix-tures.

とあるように文中でも大文字で書いています。

参考

1. Daniel J. Klionsky　Blame it on Southern, but it’s a western blot 　Autophagy. 2017; 13(1): 1–2. 2016 Nov 28. doi: 10.1080/15548627.2016.1255382
2. Do I Capitalize Western Blot? November 25, 2013　advansta.com　Many science editing sites online also agree with not capitalizing western blot. However, the CDC page on writing style recommends Western blot, the online Oxford Dictionary gives the following example for use of the term, “The sample could not be confirmed positively by Western blot,” and the Merriam Webster Dictionary recognizes both Western and western blot.

 

世界最初のウエスタンブロット: ウエスタンブロット法の発明者は誰か

ウエスタンブロット法を発明したのは誰でしょうか？自分が編み出した実験手法をウエスタンブロッティングと名付けたのはW. Neal Burnetteでしたが、その論文はリジェクトを食らってしまい論文発表が遅れているうちに、スイスのHarry Towbinのグループおよびスタンフォード大（アメリカ）のGeorge Stark のグループが、同様の手法に関する報告を1979年に相次いで出しました。Burnetteが論文発表できたのは彼らよりも2年遅れの1981年です。

科学研究業界の掟として、最初に論文を出した人が最初の発見者とみなされます。そのルールに則ればBurnetteはウエスタンブロット法の発明者ではなくなってしまいますので、誰がウェスタンブロット法を発明したのかが第三者には少しわかりにくくなっています。しかし、Burnetteの論文がリジェクトされた理由は、査読者がジョークによる命名を気に入らなかっただけという不条理なものでした。また、Burnette は自分の方法が他の２つよりも簡便かつ優れていると考え、論文のプレプリントを知り合いの研究者に配布したところ、それが他の研究者にもコピーされて彼の手法が爆発的に広まりました。Burnetteは、Analytical Biochemistryに対して1979年のリジェクトの不条理さを訴えて結果的に1981年のアクセプトにこぎつけました。こういった事情から、W. Neal Burnetteがウェスタンブロットの発明者とみなされているようです。

When Burnette submitted his methodology to Analytical Biochemistry in 1979, it was not very well received and his manuscript was rejected. This was largely due to their distaste for the naming convention. (South, north, east and west-ern: the story of how the western blot came into being 18 JUL 2018 WRITTEN BY ABIGAIL SAWYER BioTechniques)

論文投稿は、投稿先の雑誌を変更してしまうとまたゼロからのやり直しですが（最初の投稿のタイミングが、認められない）、同じ雑誌社でのアクセプトを目指して再投稿する権利を確保しながら粘った場合には、投稿からアクセプトまでが途切れていないので、最初の投稿のタイミングが成果のクレジットを与える根拠として確保されます。

 

3グループによる初期のイムノブロット法の比較

論文化が2年おくれはしましたがNeal Burnetteは自分の方法が一番優れていると信じていたそうです。３つの論文で報告された手法は何が同じで何が異なるのでしょうか？比較してみます。

研究グループ	W. Neal Burnetteら（アメリカ　シアトル）	Harry Towbinら（スイス）	George Starkら（アメリカ　スタンフォード大学）
論文発表年と雑誌	1981年　Analytical Biochemistry　ただし最初の投稿は1979年	1979年9月1日　PNAS （communicated, June 12, 1979 ）	1979年7月1日　PANS (communicated, April 4,1979 )
論文名	“Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A	Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.	Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.
DOI	10.1016/0003-2697(81)90281-5	10.1073/pnas.76.9.4350	10.1073/pnas.76.7.3116
電気泳動	sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel		polyacrylamide/agarose composite gels, with or without sodium dodecyl sulfate
タンパク質をメンブレンへ転写する方法	電圧をかける		blotting overnight at room temperature, using 50mM sodium phosphate, pH 7.5, essentialy as described for DNA transfers by Southern
メンブレンの種類	sheets of pure, unmodified nitrocellulose		Diazobenzyloxymethyl (DBM)-paper
一次抗体			specific antiserum
一次抗体の検出方法	radioiodinated Staphylococcus protein A		125I-labeled protein A
可視化の方法			autoradiographed, by using Kodak XR-5 film and a Du Pont Cronex Lightning-plus XL screen at -700C.

 

1. Mukhopadhyay, R. W. Neal Burnette: the man behind the Western blot. ASBMB Today, January 2012:17 – 19.
2. J Renart, J Reiser, and G R Stark. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979 Jul; 76(7): 3116–3120. doi: 10.1073/pnas.76.7.3116
3. H Towbin, T Staehelin, and J Gordon. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979 Sep; 76(9): 4350–4354. doi: 10.1073/pnas.76.9.4350
4. WESTERN BLOTTING PAST, PRESENT AND FUTURE June 21, 2017　 azure biosystems:   One of the first Western blots. Adapted from Renart J, Reiser J, Stark GR. PNAS, 1979.
5. The man behind the Western blot: W. Neal Burnette Burnette made his seminal contribution to molecular biology and biochemistry as a postdoc and went on to have an unusual career. Rajendrani Mukhopadhyay By Rajendrani Mukhopadhyay Dec. 29, 2011　ASBMBTODAY　https://www.asbmb.org/asbmb-today/people/122911/the-man-behind-the-western-blot-w-neal-burnette

 

ELISA法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay；エライザ）は、抗原特異的な抗体を用いて抗原蛋白質を定量する方法です。

呼称に関して

ELISA技術は、「酵素免疫測定法（EIA）」など別の呼称で言及される場合もあります。(ELISAに関する概要 ThermoFisher Scientific)

 

ELISA法を発明した人は誰か

２つの研究グループが、ほぼ同時期に独立にこのアッセイ法を開発したようです。

the enzyme immunoassay (EIA) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). These assays were developed independently and simultaneously by the research group of Peter Perlmann and Eva Engvall at Stockholm University in Sweden and by the research group of Anton Schuurs and Bauke van Weemen in The Netherlands.

 

ESLISAの種類

1. 様々なELISAのフォーマットのメリット・デメリット　バイオラッド
2. 直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法　MBL雷雨サイエンス　図の説明がわかりやすい
3. サンドイッチELISAと競合ELISAによる定量　M-hub
4. ELISAには直接吸着法とサンドイッチ法の２種類がある。　免疫学実習　酵素免疫定量(ELISA)法による未知蛋白の定量

 

サンドイッチELISA

サンドイッチELISAプロトコール

1. サンドイッチ ELISA プロトコール　abcam

 

1. ViroStat – サンドイッチELISAペア抗体　東京未来スタイル
2. サンドイッチELISAの利点　Sino Biological　ポリクローナルはよく捕獲抗体として使用され、できる限り多くの抗原をPull-downできる。

 

参考

1. 酵素免疫測定法の原理と問題点　臨床化学 第6巻 第2号(1978)106～115

フローサイトメトリーをやったことがない人（自分）でも、原理をわかった気になって、実験をやった(やれる）気になれそうなネット上の資料、動画を纏めました。

フローサイトメトリーとは

フローサイトメーター装置を用いて、流動する液体に懸濁した細胞やその他の粒子が一列になってレーザー光放射位置を通過し、光との相互作用が光散乱と蛍光強度として電気検出装置により測定されます。もし蛍光標識または蛍光色素が特異的かつ化学量論的に細胞構成物と結合していれば、蛍光強度は特定細胞構成物の量を表すことができます。（フローサイトメトリー入門講座　コスモ・バイオ）

フローサイトメトリーとは何かを非常に簡単に説明した動画。固定した細胞を蛍光標識した抗体で染色する様子が示されています。

Flow Cytometry Animation Cell Signaling Technology, Inc. 2016/02/04

 

フローサイトメトリーの原理

フローサイトメトリーとは何かを知るには、下の動画（12：09）が適度な詳しさで良いです。
Flow Cytometry 　Shomu’s Biology 2012/11/13

1. shomusbiology.com

前方散乱光と側方散乱光

Flow Cytometry Animation

 

アイソタイプ･コントロールとは

アイソタイプ･コントロール（Isotype control）抗体は特定の抗原とは反応しない抗体で、フローサイトメトリーや免疫組織染色で得られた結果を正しく評価するための、ネガティブ･コントロールとして使用します。(アイソタイプ･コントロールを選ぶポイント abcam.co.jp)

フローサイトメトリーにおいて、アイソタイプコントロールを使用するかどうかは、論争の的であり、研究者を二分しています（Herzenberg Lら、Maecker HTおよびTrotter J）。(アイソタイプコントロール (Isotype controls) bio-rad.co.jp)

 

サンプルローディングとデータ取得

Running a Basic 2 color Flow Cytometry Experiment in BD FACS Diva

 

ゲーティングとは

ＦＡＣＳの実験の話を聞いていると、ゲーティングという言葉が頻繁に登場します。ＦＡＣＳの実験を行っている人にとってあまりにも当たり前過ぎる単語のため、誰もゲーティング(Gating）が何かまでは説明してくれません。

Subsets of data can be defined through gating. A gate is a numerical or graphical boundary used to isolate subpopulations of particles/cells in order to generate statistics on a limited number of events in a given sample. (Flow Cytometry – A Survey and the Basics Tom Rowley (tjrowley3 at gmail dot com) Columbia University, United States labome.com)

ゲーティングとは、大きさや分散の程度などによって細胞の特定の領域または集団をデータ上で選択または除外することです。主な目的は細胞の残骸や破片などネガティブな集団を除くことですが、最近のソフトウェアでは様々な条件でゲートの設定を行うことができます。（フローサイトメトリー 10 のポイント　abcam.co.jp）

現在，頻用されているgating法は大きく3つに分類さ れ，まず第1に先に示したSSC/FSC cytogramからのgatingで光学形態情報（大きさ，内部構造）から細胞の位置を推察しgating行う方法。第2は，全白血球に反応するCD45抗体の蛍光強度と他のCD抗体の蛍光強度より二次元に展開するCD45/CD14 cytogram（Fig.1b），あ るいは，CD45抗体とSSC（Fig.1c）などの方法。第3は， 測定する目的細胞の特徴的マーカーを利用したgating 法で，例えば成熟型リンパ性腫瘍（悪性リンパ腫；ML， 慢性リンパ性白血病；CLL，成人T細胞白血病；ATL 等）では，各々の腫瘍の系統別のマーカーとSSC cytogram（SSC/CD19，SSC/CD3），および，両軸とも 特異抗体の蛍光強度で展開するcytogram（CD5/CD19， CD3/CD4）などの2種抗体gating法がある。（日常検査におけるFCM測定の問題点 － gating ー 鶴田 一人・上平 憲 Cytometry Research 12(1) : 39～48，2002　ＰＤＦ）

1. FCMの原理入門講座Ⅷ.データ処理系 (bc-cytometry.com)
2. 初心者のためのＦＣＭ入門 (ベックマン・コールター）原理、ゲート解析など明解な解説。
3. 6 Flow Cytometry Gating Tips That Most Scientists Forget

 

FACS実験の実際（ＪＯＶＥ）

日常的にその実験している人にとっては、何も目新しいことがない実験・装置であっても、全くの未経験者が見ると役に立つことが多いのが、映像による実験の紹介です。そういう意味で、JoVEは非常に人の役に立つビデオジャーナルだと思います。

実際の実験でゲーティングして細胞を分取するところ（11:58　Experimental Sample Gating & Sorting）などを動画で見ることができます。

 

1. Introduction to Flow Cytometry:A Learning Guide )2002 Becton, Dickinson and Company)

ゲーティング戦略

1. Flow cytometry gating strategy for T cells, B cells, eosinophils and dendritic cells. Whole lung cell tissues were stained for the T cell markers CD3, CD4, CD8; the B cell marker B220; dendritic cell marker CD11c, major histocompatibility complex class II (MHC II) marker, and the activation markers CD69 and CD86.
2. Gating Strategy for the Identification of ILC2s DOCUMENT # 27030 VERSION 1.0.0 JUL 2017 Download PDF
3. Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry.
4. Gating strategy for ILC3s in RORc-eYFP mice: after exclusion of doublets, live CD45⁺ B220⁻ CD3⁻ TCRβ⁻ YFP⁺ cells were selected.

 

フローサイトメトリーデータの表示方法

下の動画では、（30：22～から）ヒストグラム(Histogram)、ドットプロット(Dot Plot)、デンシティプロット(Density Plot)、2変数プロット、ゲートなどが説明されています。

Basics of flow cytometry, Part I: Gating and data analysis　Thermo Fisher Scientific 2016/12/28

フローサイトメトリー装置の種類

セルソーター（自動細胞解析分取装置）：MoFlo Astrios EQ  （ジェットインエア方式）、MoFlo XDP  （ジェットインエア方式）、FACSAria （キュベットフローセル方式）

セルアナライザー（自動細胞解析装置） 細胞の分取機能を持たない解析専用。Cytomics FC500、 Gallios、 FACSCalibur、 FACSCanto。

高速型セルアナライザー 高速型フローサイトメーターは1秒間に5万個以上のスピードで測定可能です。CyAn ADP

※ FACSはBecton Dickinson社の商標です。（フローサイトメトリーの概要　bc-cytometry.com）

フローサイトメトリー実験の注意点

下の記事は、フローサイトメトリーの原理から始めて、実験の注意事項までバランス良く解説しています。

フローサイトメトリーでは，一般的には10^4～10^6細胞分のデータを取得する．したがって，免疫染色や測定操作を正確に行っていれば，取得データ全体の統計的な精度は高く維持できる．ところが，上述のゲーティング操作によって集団のうちの一部の亜集団を多重パラメータで解析すると，最終的に抽出された集団の細胞数が非常に小さくなる場合がある．しかも，絶対数が小さいが故に，ゲーティング操作で扱う細胞集団の囲みが少しずれるだけでデータが変化してしまうこともある．この部分は，フローサイトメトリーのデータを扱う上で，もっとも細心の注意を払うべき部分であり，無意識のうちに都合のよいデータに改ざんしてしまわないように気をつけなければならない．(フローサイトメトリー ～「前にならえ」並べて順に数えます～ 金山 直樹 生物工学 第90巻 2012年 第12号 PDF)

 

マルチカラーフローサイトメトリー

複数の種類（波長）の色素を用いることにより、複数のマーカー分子を用いて、細胞のタイプを分けることができます。

Multicolor Panel Building in Flow Cytometry 　Bio-Rad Laboratories 2017/11/13

Lymphocytes分類の例（上の動画６：４７～）
ナチュラルキラー（NK）細胞（全てCD56陽性）の2つのサブセット：CD57陽性、CD57陰性CD16陽性
ナチュラルキラーＴ（NKT）細胞（全てCD3陽性、CD56 陽性）の6個のサブセット：CD8低CD57陰性、CD低CD57陽性、CD8中CD57 陰性、CD8中CD57陽性、CD8高CD57陰性、CD8高CD57 陽性

1. Multicolor flow cytometry – Understanding the basics [WEBINAR]  FITC and PE (4:08~)

マルチカラーフローサイトメトリーで使われる色素

The fluorochromes used are: fluorescein (FITC), phycoerythrin (PE), Cy5PE and Cy7PE, excited at 488 nm by an argon laser; Texas Red (TR), allophycocyanin (APC), and Cy7APC excited at 595 nm by a pumped dye laser; and cascade blue (CB) and cascade yellow (CY) excited at 407 nm by a violet-enhanced krypton laser. (Cytometry. 1999 May 1;36(1):36-45. Nine color eleven parameter immunophenotyping using three laser flow cytometry. PubMed)

1. Selecting Reagents for Multicolor Flow Cytometry Holden Maecker and Joe Trotter BD Biosciences, San Jose June 2012 
2. Commonly Used Fluorochromes and Their Properties (umc.edu)
3. Fluorophores (Flow Cytometry at Einstein) When performing multicolor flow cytometric analysis, a major factor in the success of the analysis is the choice of which antibody to use with which fluorochrome. There are often many “correct” combinations possible. 

 

Tandem dyes for flow cytometry 

Tandem dyes comprise a small fluorophore covalently coupled to another fluorophore. When the first dye is excited and reaches its maximal excited electronic singlet state, its energy is transferred to the second dye (an acceptor molecule). This activates the second fluorophore, which then produces the fluorescence emission. The process is called Förster resonance energy transfer (FRET). (Which Fluorophores are Useful for Flow Cytometry? BIO-RAD)

1. Flow cytometry APC‐tandem dyes are degraded through a cell‐dependent mechanism Christine Le Roy Nadine Varin‐Blank Florence Ajchenbaum‐Cymbalista Rémi Letestu First published: 08 September 2009 https://doi.org/10.1002/cyto.a.20774 

フローサイトメトリーのプロトコール

1. Flow cytometryのための表面抗原染色（FITC, PI）　実験プロトコール　東京医科歯科大

 

参考

1. Take Control of Your Flow Cytometry (Bio-Rad Laboratories 2016/11/23 YOUTUBE 28：49）
2. FACS – Fluorescence Activated Cell Sorting (Steffen Schmitt (DKFZ)  iBiology Techniques YOUTUBE 30:00)

リアルタイムPCRは遺伝子発現量を調べる手法として今ではすっかり普通の実験になりましたが、いざ実験しようとすると再現性が悪かったり、そもそも、遺伝子発現量を議論する（絶対量？相対量？比較対象は何と何？）ためにはどういう実験デザインにしてどんな解析をすべきなのかが初心者にとってはすぐには明らかではなかったりもします。そこで、わかりやすい解説記事をまとめておきます。

 

リアルタイムPCRとは

リアルタイムPCR（real-time PCR）は、定量PCR（quantitative polymerase chain reaction）、qPCR、RT-ｑPCR (Reverse Transcription quantitative PCR)などとも呼ばれもので、PCR反応で生成されている産物の量を蛍光標識してリアルタイムに測定・記録することにより、指数関数的に増幅している部分を利用して鋳型の量を定量的に解析するものです。絶対的な量を算出するか、相対的なサンプル間の比を算出するかは、実験デザインと解析方法で変わってきます。

リアルタイム PCR は、定量的逆転写 PCR (RT-qPCR) や定量的 PCR (qPCR) としても知られますが、最もパワフルかつ高感度な遺伝子解析技術の一つです。…　リアルタイム PCR は、PCR増幅が起こるそのタイミングから核酸の定量を行います。（リアルタイムPCR のコンセプト 遺伝子発現の概要：入門ガイド　サーモフィッシャーサイエンティフィック）

 

リアルタイムPCRのデータ解析方法概説

1. リアルタイムPCRの遺伝子発現解析をより正確に行うために（PDF)(日本バイオ･ラッド ラボラトリーズ株式会社　副島正年，井口潤一 yodosha.co.jp)　検量線を用いた相対的定量、比較Ct法（Livak法）、比較Ct法（Pfaffl法とVandesompele法）
2. リアルタイム定量PC法の原理と活用 (PDF) （有賀博文　Nippon Suisan Gakkaishi 73(2):292-295 (2007).）PCR初期ではPCRの阻害となる要因がほとんど無いためPCRプロダクトは指数関数的に増幅する

3. 絶対定量と比較定量の違いとは？リアルタイムPCRの主な4つのデータ解析方法（サーモフィッシャーサイエンティフィック）

4. リアルタイムPCR再入門（PDF)(BIO-RAD)

 

検量線法（絶対定量法）

絶対定量法とは、あらかじめ濃度の分かっている目的産物のDNAを段階希釈し、希釈系列を用いてReal time PCRを行い検量線を書き、濃度不明のサンプルのCt値を検量線にあてはめコピー数を計算するものである。（リアルタイムPCR　ウィキペディア）

1. リアルタイムPCRによる多種細胞間の発現量の比較（Biotechnical Forum)

 

比較Ct法（相対定量法）

ΔΔCt法は、比較Ct法(comparative Ct method) 、2(-Delta Delta C(T)) Methodなどとも呼ばれます。Livak and Schmittgen 2001の論文で計算の過程が丁寧にわかりやすいく説明されています。

1. Relative Quantitation Using Comparative CT Getting Started Guide (120-page PDF)ThermoFisher Scientific)
2. 比較Ct法では，
   ⊿Ct＝ターゲット遺伝子Ct－内在性コントロールCt（チューブ毎の値で算出）
   ⊿⊿C＝各サンプル⊿Ct－基準サンプルの平均⊿Ct 
   得られた⊿⊿Ctを2^(-⊿⊿Ct)にあてはめてコピー数の比較を行う
   の３つの計算を行って比較します．(qPCRデータのまとめ方が分かりません。(2) YAHOO!JAPAN知恵袋)
3. デルタデルタCT法でのthresholdの設定（Bio　Technica　lForum)

4. 検量線をひかずに定量する比較Ct法の実験データ｜今こそ本気で徹底理解! リアルタイムPCR講座 第14回（サーモフィッシャーサイエンティフィック）

ΔΔCt法と検量線法とどちらを使うべきか

1. リアルタイムqPCRの定量化。ベターなのはどちら？（jikken110.com）

 

定量PCRにおいて遺伝子発現量を遺伝子間で比較することの是非に関して

1. リアルタイムPCRで遺伝子間の発現量を比べることは可能か（Biotechnical Forum)

2. How I can compare a relative ratio of the basal mRNA expression of 2 genes in the same cell line by qRT-PCR? (ResearchGate)

3. Can I compare the expression of two genes only based on their Ct value? (ResearchGate)

4. How to determine relative expression of genes compared to a reference gene using qPCR Ct values? (ResearchGate) I do not have treated and untreated samples. I just want to know how much of gene A is expressed relative to gene B and/or the reference gene.
5. Is it possible to compare abundance of isoforms by qPCR（PROTOCOL ONLINE)

 

リアルタイムPCR実験の実際

1. リアルタイム PCR の予備実験（PDF)（med.kyushu-u.ac.jp）リアルタイム PCR がなかなかうまくいかない、という方の中には予備実験をされてない方が多くいらっしゃいます。実際に大量のサンプルをかける前に、下記のことをご確認ください。

 

リアルタイムPCR実験のトラブルシューティング

1. トラブルシューティング （PDF)(takara-bio.co.jp)
2. これでもう失敗しない！リアルタイムPCRに失敗する4つの問題点と解決策をご紹介 (サーモフィッシャーサイエンティフィック)

 

リアルタイムPCRに関する参考ウェブサイト

1. タカラバイオ　リアルタイムPCR実験ガイド　はじめてのリアルタイムPCR:リアルタイムPCRによる定量の原理、装置と検出方法、プライマー設計、実験プロトコール、解析方法　リアルタイムRT-PCRによる遺伝子発現解析:リアルタイムPCRの基礎知識,リアルタイムRT-PCR実験法,解析法,トラブルシューティング　リアルタイムPCR実践編:プライマー設計ガイドライン, インターカレーター法によるリアルタイムRT-PCR（用意するもの、プロトコール、PCR反応条件、留意点）　リアルタイムPCRの応用: 遺伝子発現解析,DNAマイクロアレイ結果の検証,siRNA効果の確認,病原菌遺伝子の検出・定量,SNPsのタイピング　Q＆A:リアルタイムPCR実験ガイドのQ&A
2. バイオラッド　リアルタイムPCR再入門（PDF)
3. Relative quantification　Michael W. Pfaffl in: Real-time PCR. Published by International University Line (Editor: T. Dorak), p 63-82
4. https://www.gu.se/digitalAssets/1125/1125331_ABI_-_Guide_Relative_Quantification_using_realtime_PCR.pdf
5. http://bioanalysisforum.jp/images/2018_9thJBFS/P6_DG2017-33.pdf

 

リアルタイムPCRデータの解析方法に関する論文

1. An improvement of the 2ˆ(–delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinforma Biomath. 2013 Aug; 3(3): 71–85. (PubMed PMC4280562)
2. Livak and Schmittgen 2001 

 

Rで解析するリアルタイムPCRデータ

1. Analysis of real-time qPCR data　2018-07-24　Mahmoud Ahmed

刺激作成・呈示用のソフトウェアが開発されたおかげで、必ずしもプログラミングができない人・学生であっても心理学実験、心理物理学実験を実践できる状況が整ってきたと思います。選択肢がいくつかあって迷うため、無料有料問わず研究者に使われているツールを取り上げて、それぞれの特徴をまとめておきます。多くの人が使っているソフトのほうが、資料やサンプルコードが豊富にあって勉強しやすいという事情があるため、プログラミングに自信がなければ、テクニカルサポートが受けられる有料ソフトか、時流に乗った無料ソフトを選択するのが無難でしょう。

 

PsychoPy

ネット上のドキュメントの豊富さで一番、その隆盛ぶりを感じるのが、PsychoPy（さいこぱい）です。

公式サイト：psychopy.org

価格：無料。これはPythonで開発されており、プログラミングが全くできない人でも（グラフィカルユーザーインターフェースBuilderを使用して）とりあえず心理物理学実験の刺激を作ったり動作さることができて、もしプログラミングができる人なら（コードエディタCoderを使って）さらに高度なことができるという特徴があります。

開発者＆開発の歴史：Jon Peirce氏が自分の研究室で使うために2002年から開発。他の研究者からの要望が増大したためそれに応える仕様に拡充。2007年にソフトウェアPsychoPy開発に関する論文を発表。2010年から2011年にかけて、学生がプログラミングなしでPsychoPyを使えるようにとBuilderを開発。これによりPsychoPyの利用者が劇的に増加し、利用者数16000人、開発者数総勢70人の規模にまでPsychoPyコミュニティが育ってきている（参照：Building Experiments in PsychoPy)。

Build your first PsychoPy experiment (Stroop task)

PsychoPyのダウンロードとインストール

PsychoPy Builder で作る心理学実験（十河 宏行 著）が参考になります。自分の場合ウインドウズ１０のPCを使っているので、https://github.com/psychopy/psychopy/releasesで、StandAlonePsychoPy3と書いてあるウインドウズ用インストーラをクリックしてインストールを行ってみました。すると普通のアプリケーションのように、PsychoPy3がスタートメニュー等に並び、アイコンをダブルクリックすることにより、PsychoPy3のBuilderとCoderが表示されました。

 

PsychoPyを勉強するためのリソース・参考ウェブ記事：

1. 『Building Experiments in PsychoPy』PsychoPyの開発者らが書いた入門・実践書
2. PsychoPyディスカッションフォーラム

3. 開発者Jon Peirce氏のYOUTUBEチャンネル

4. PsychoPy Builderで作る心理学実験
5. PsychoPy講座（ogwlab 関西学院大学）
6. PsychoPyを使った初学者向けの心理実験環境の構築（スライドシェア）小川洋和　関西学院大学文学部総合心理科学科
7. 初学者向けの心理実験環境としての PsychoPy　関西学院大学文学部 教授　小川洋和（小特集プログラミングThe心理学実験　日本心理学会）
8. PsychoPyを使って認知課題を作ってみよう！専修大学人間科学部　国里ゼミ
9. PsychoPyの実験プログラムのサンプル　井関龍太のページ
10. PsychoPy Builder で作る心理学実験 リリース 2.1 十河宏行 12 月 18, 2018（PDF)
11. 『心理学実験プログラミング: Python/PsychoPyによる実験作成・データ処理』十河 宏行 著 朝倉書店 2017年
12. 【書評】十河宏行著，心理学実験プログラミング：Python/PsychoPyによる実験作成・データ処理（小川洋和）
13. PsychoPy + Jupyter Notebookで快適な心理学実験・分析環境を構築する Qiita　@mytk0u0　2018年03月16日
14. PsychoPyでじゃんけんプログラム（Python）

 

Matlab with Psychophysics toolbox

PsychtoolboxはMatlabのツールボックスとして開発されていますが、Matlabの無料コピー版みたいな存在であるGNU Octaveでも動くと述べられています。また、マック、ウインドウズ、リナックスに対応しています。ただし、全てのプラットフォームで全部のことができるとは保証されていなくて、基本的にマックとMatlabの組み合わせで使う環境が優先的に開発されている印象があります。Matlabのプログラミングができる人向けです。

公式サイト：psychtoolbox.org

価格：Psychophysics toolbox自体は無料ですが、高価なソフトウェアMATLABの中で使います。ただし、Psychophysics toolboxはMATLABだけでなくMATLABのそっくりさんで無料ソフトのGNU Octaveにも対応しているので、全て無料でできる可能性はあります。ただし、Psychtoolboxの開発にあたって、OCTAVEへの対応がMATLABと同じくらい行き届いているとは思えないので、自分がやりたいことがOctaveでも実行可能かの注意が必要でしょう。

 

Psychtoolboxを勉強するためのリソース

1. 書籍『はじめよう実験心理学: MATLABとPsychtoolboxを使って』実吉 綾子, 前原 吾朗 著　勁草書房　2015
2. 個人ブログ　Psychtoolboxsをがんばる：心理学、実験、プログラミング
3. MATLAB & Psychtoolbox Tutorial Part2: Example – Choice RT jianglab UM Psychology Jiang Lab
   YOUTUBE動画シリーズ

 

OpenSesame

公式サイト：osdoc.cogsci.nl

 

PsyScope

無料ソフトで、アップル社のマッキントッシュコンピュータで動作。

公式サイト　psy.ck.sissa.it

PsyScope is a program to design and run psychological experiments, used by many experimental labs. It runs on Apple Macintosh computers.　http://psy.ck.sissa.it/

 

Presentation

公式サイト：neurobs.com

価格：学生一人99ドルから（参照：ライセンスの価格）

 

E-Prime

E-Prime®

• ライセンス価格：シングルユーザー995ドル（参考サイト）

 

心理物理学実験を設計する際の注意点

1. 高い時間精度での視聴覚刺激の呈示と反応データの取得のために必要なハードウェアトソフトウェア　菅野禎盛　経営学論集２５（４）６３－７１　2015年3月　九州産業大学

 

参考（心理学実験・心理物理学実験）

1. PEPE　プログラミング THE 心理実験　心理学ワールドの67号の小特集に関連したページ　心理学ワールドの記事と日本心理学会第７８回大会のシンポジウムでは、無償で導入でき、実用性の高い環境として、PsychoPy, Psychlops, Psychtoolbox, Processingの４つについて紹介しています。PsychoPyは関西学院大学の小川洋和先生に、Psychlopsを電気通信大学の中嶋豊先生に、Psychtoolboxを九州大学の黒木大一朗先生と東京海洋大学の草野勉先生に、Processingを京都大学の津田裕之先生に解説していただきました。

バイオ研究者にもはんだ付けは必要

生物学の研究者でふだんピペットマンをつかってDNAワークばかり行っている人は、そうそう仕事ではんだ付けをやる機会がないでしょう。しかしそんなバイオ系のラボでも研究内容によってはちょっとした電気工作ではんだ付けをする必要が生じることがあります。学校ではんだ付けを習ったのは中学の技術の時間だったと思いますが、それからずいぶん歳月が流れているため、ふだん電気工作を趣味にしているのでもない限り、何をどうしたらいいのかわからない人が多いでしょう。

• 最近の普通中学校では、技術家庭科の授業でハンダ付けの実技はないのですか？2018/12/1601:20:15　YAHOO!JAPAN知恵袋

そんなわけで、はんだ付けを行うにあたっての注意事項や基本的な手順などを解説したサイトをまとめて紹介します。

 

はんだ付けに必要な道具

温度調節可能な半田ごて、糸はんだ（ヤニ入り）、部品を保持するためのクリップ台、こて台＆クリーナー、ハンダ吸い取り線（ウィック）があれば、はんだ付けができます。

 

はんだ付けの基本操作と注意点

はんだ付けを自己流で初めてやろうとすると、迷うことがたくさんあります。人間に手は二本しかないのに、はんだ付けによってくっつけたい部品は当然2個あるわけですし、はんだごてと糸はんだもあるので、手が合計4本必要ではないですか？どうすればいいのでしょう？２つの部品を保持するクリップの台があると便利です。基盤に部品をはんだ付けする際には部品が動かないようにどうやって固定すればよいのでしょうか？（マスキングテープで止めるといいらしい）そしていざはんだ付けをする際には、はんだごてをどこに当てて、糸はんだはどこに当てて溶かせばいいのでしょうか？当たり前のことがわからないというはとてもストレスフルです。簡単に言うと、

１．プリント基板の「ランド」と部品の足に同時にこて先を当てて温め、
２．じっくりあったまったところにハンダを軽～く付けて、
３．「いち、に」と数え、
４．ハンダを先にどかして、
５．こてを離す。

ハンダごてを買わされ、そして教わる1

 

（ハンダごてを買わされ、そして教わる　2018年9月3日　デイリーポータルZ）

ということになるようです。これは電気部品を基板に固定する場合の話ですが。上のサイトは動画もあってとても分かりやすいです。この記事で紹介されている温度が調節できる半田ごては自分も使っています（HAKKOのFX-601という機種)。充分あたたまった部品にはんだがスッと溶けて間を埋めるのが、良い仕上がりということのようです。はんだごてと糸はんだはどちらを先に離すべきかなんて、初心者だとうっかり間違えそうなポイントですね。考えたら当たり前なのですが。

正しいハンダ付けは、表面がなめらかでデコボコしておらず、富士山のような形をしています。…　ハンダ付けをうまく行うには「ハンダを約250℃で、約3秒間溶融させる」だけなのです。…　一番確実な方法は、「温度調節機能つきのハンダゴテ」を使うことです。コテ先温度を340～360℃にコントロールします。（初心者でも失敗しないハンダ付けのコツ！　2015年7月9日/2018年1月16日更新　ものづくりの今がわかる工場タイムズ）

上記の記事も、失敗しないコツがいろいろと解説されていて、はんだ付けにチャレンジする前の必読記事でしょう。

自分は、何年も前に野瀬氏のハンダ付けの教科書と動画チュートリアルDVDと半田ごてセットを買い、それをずっと使っています。久ぶりにウェブサイトを見たら会社の名前がカッコよく今風（ハンダの神様？ゴッドハンドを持つ人間？）になってました。

会社名 ゴッドはんだ株式会社（株式会社ノセ精機は、社名変更しました）
代表取締役社長 野瀬　昌治　https://noseseiki.com/sp/index.html

リード型（アキシャル）抵抗のはんだ付けお手本（体験用基板を使用）効果音

 

 

リード部品（Dip部品）のはんだ付け（古賀電子）のウェブサイトも、写真入りでとてもわかりやすくはんだ付けの基本工程が解説されています。そうそう、やってみると、糸はんだを早く離しすぎて全然足りてなかったりもするものなのですね。糸はんだを当てる場所は、この記事の説明だと半田ごての先ではなくて、基盤の「ランド」と部品のリード線の部分だということです。上で紹介したゴッドはんだの動画だと、はんだごてに当てているように見えますので、流儀が人によって異なる部分があるのかもしれません。どちらがどうということは自分には全くわかりませんが。糸はんだを話したあとも半田ごては１～２秒おいておくというのは、これらの解説を読むまで知りませんでした。部品を熱を破損させないか恐いと思っていると、ついつい慌てて離してしまいそうなところですが、間を取るべき部分ではしっかりと間をとるということのようです。

 

フラックスって何？

はんだ付けといえば、くっつけたい電子・電気部品や基盤などを接触させて、はんだごてを当てて、糸はんだの先を当てて溶かすだけだと思っていました。ところが、はんだ付の成功のカギを握る要素として、「フラックス」なるものがあるんだそうです。フラックスとは一体何なのでしょうか？

初心者が半田付けをする場合、よくやってしまうのが、熱した半田コテ先に真っ先に糸半田を接触させて半田を溶かそうとすることです。　これをやってしまうと、フラックスは一気に高温になり、蒸気となって煙として なくなってしまい1.2.3.の働きをする間もなく、蒸発してしまいます。フラックスのなくなった半田は、即酸化して、コテコテベタベタで、まったく流れなくなってしまいます。　（ツノが出たり、オーバーヒートを起こして表面が凸凹、ザラザラになる）（ごっどはんだ）

 

参考

1. はんだ付けのコツ！基本のテクニックで簡単＆きれい！溶けない理由も解説　2018年10月18日　暮らしーの