フローサイトメトリー(Flow Cytometry), FACS (Fluorescence assisted cell sorting)の原理と実際

フローサイトメトリーをやったことがない人（自分）でも、原理をわかった気になって、実験をやった(やれる）気になれそうなネット上の資料、動画を纏めました。

フローサイトメトリーとは

フローサイトメーター装置を用いて、流動する液体に懸濁した細胞やその他の粒子が一列になってレーザー光放射位置を通過し、光との相互作用が光散乱と蛍光強度として電気検出装置により測定されます。もし蛍光標識または蛍光色素が特異的かつ化学量論的に細胞構成物と結合していれば、蛍光強度は特定細胞構成物の量を表すことができます。（フローサイトメトリー入門講座　コスモ・バイオ）

フローサイトメトリーとは何かを非常に簡単に説明した動画。固定した細胞を蛍光標識した抗体で染色する様子が示されています。

Flow Cytometry Animation Cell Signaling Technology, Inc. 2016/02/04

 

フローサイトメトリーの原理

フローサイトメトリーとは何かを知るには、下の動画（12：09）が適度な詳しさで良いです。
Flow Cytometry 　Shomu’s Biology 2012/11/13

  1. shomusbiology.com

前方散乱光と側方散乱光

Flow Cytometry Animation

 

アイソタイプ･コントロールとは

アイソタイプ･コントロール（Isotype control）抗体は特定の抗原とは反応しない抗体で、フローサイトメトリーや免疫組織染色で得られた結果を正しく評価するための、ネガティブ･コントロールとして使用します。(アイソタイプ･コントロールを選ぶポイント abcam.co.jp)

フローサイトメトリーにおいて、アイソタイプコントロールを使用するかどうかは、論争の的であり、研究者を二分しています（Herzenberg Lら、Maecker HTおよびTrotter J）。(アイソタイプコントロール (Isotype controls) bio-rad.co.jp)

 

サンプルローディングとデータ取得

Running a Basic 2 color Flow Cytometry Experiment in BD FACS Diva

 

ゲーティングとは

ＦＡＣＳの実験の話を聞いていると、ゲーティングという言葉が頻繁に登場します。ＦＡＣＳの実験を行っている人にとってあまりにも当たり前過ぎる単語のため、誰もゲーティング(Gating）が何かまでは説明してくれません。

Subsets of data can be defined through gating. A gate is a numerical or graphical boundary used to isolate subpopulations of particles/cells in order to generate statistics on a limited number of events in a given sample. (Flow Cytometry – A Survey and the Basics Tom Rowley (tjrowley3 at gmail dot com) Columbia University, United States labome.com)

ゲーティングとは、大きさや分散の程度などによって細胞の特定の領域または集団をデータ上で選択または除外することです。主な目的は細胞の残骸や破片などネガティブな集団を除くことですが、最近のソフトウェアでは様々な条件でゲートの設定を行うことができます。（フローサイトメトリー 10 のポイント　abcam.co.jp）

現在，頻用されているgating法は大きく3つに分類さ れ，まず第1に先に示したSSC/FSC cytogramからのgatingで光学形態情報（大きさ，内部構造）から細胞の位置を推察しgating行う方法。第2は，全白血球に反応するCD45抗体の蛍光強度と他のCD抗体の蛍光強度より二次元に展開するCD45/CD14 cytogram（Fig.1b），あ るいは，CD45抗体とSSC（Fig.1c）などの方法。第3は， 測定する目的細胞の特徴的マーカーを利用したgating 法で，例えば成熟型リンパ性腫瘍（悪性リンパ腫；ML， 慢性リンパ性白血病；CLL，成人T細胞白血病；ATL 等）では，各々の腫瘍の系統別のマーカーとSSC cytogram（SSC/CD19，SSC/CD3），および，両軸とも 特異抗体の蛍光強度で展開するcytogram（CD5/CD19， CD3/CD4）などの2種抗体gating法がある。（日常検査におけるFCM測定の問題点 － gating ー 鶴田 一人・上平 憲 Cytometry Research 12(1) : 39～48，2002　ＰＤＦ）

  1. FCMの原理入門講座Ⅷ.データ処理系 (bc-cytometry.com)
  2. 初心者のためのＦＣＭ入門 (ベックマン・コールター）原理、ゲート解析など明解な解説。
  3. 6 Flow Cytometry Gating Tips That Most Scientists Forget

 

FACS実験の実際（ＪＯＶＥ）

日常的にその実験している人にとっては、何も目新しいことがない実験・装置であっても、全くの未経験者が見ると役に立つことが多いのが、映像による実験の紹介です。そういう意味で、JoVEは非常に人の役に立つビデオジャーナルだと思います。

実際の実験でゲーティングして細胞を分取するところ（11:58　Experimental Sample Gating & Sorting）などを動画で見ることができます。


 

  1. Introduction to Flow Cytometry:A Learning Guide )2002 Becton, Dickinson and Company)

ゲーティング戦略

  1. Flow cytometry gating strategy for T cells, B cells, eosinophils and dendritic cells. Whole lung cell tissues were stained for the T cell markers CD3, CD4, CD8; the B cell marker B220; dendritic cell marker CD11c, major histocompatibility complex class II (MHC II) marker, and the activation markers CD69 and CD86.
  2. Gating Strategy for the Identification of ILC2s DOCUMENT # 27030 VERSION 1.0.0 JUL 2017 Download PDF
  3. Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry.
  4. Gating strategy for ILC3s in RORc-eYFP mice: after exclusion of doublets, live CD45+ B220− CD3− TCRβ− YFP+ cells were selected.

 

フローサイトメトリーデータの表示方法

下の動画では、（30：22～から）ヒストグラム(Histogram)、ドットプロット(Dot Plot)、デンシティプロット(Density Plot)、2変数プロット、ゲートなどが説明されています。

Basics of flow cytometry, Part I: Gating and data analysis　Thermo Fisher Scientific 2016/12/28

フローサイトメトリー装置の種類

セルソーター（自動細胞解析分取装置）：MoFlo Astrios EQ  （ジェットインエア方式）、MoFlo XDP  （ジェットインエア方式）、FACSAria （キュベットフローセル方式）

セルアナライザー（自動細胞解析装置） 細胞の分取機能を持たない解析専用。Cytomics FC500、 Gallios、 FACSCalibur、 FACSCanto。

高速型セルアナライザー 高速型フローサイトメーターは1秒間に5万個以上のスピードで測定可能です。CyAn ADP

※ FACSはBecton Dickinson社の商標です。（フローサイトメトリーの概要　bc-cytometry.com）

フローサイトメトリー実験の注意点

下の記事は、フローサイトメトリーの原理から始めて、実験の注意事項までバランス良く解説しています。

フローサイトメトリーでは，一般的には10^4～10^6細胞分のデータを取得する．したがって，免疫染色や測定操作を正確に行っていれば，取得データ全体の統計的な精度は高く維持できる．ところが，上述のゲーティング操作によって集団のうちの一部の亜集団を多重パラメータで解析すると，最終的に抽出された集団の細胞数が非常に小さくなる場合がある．しかも，絶対数が小さいが故に，ゲーティング操作で扱う細胞集団の囲みが少しずれるだけでデータが変化してしまうこともある．この部分は，フローサイトメトリーのデータを扱う上で，もっとも細心の注意を払うべき部分であり，無意識のうちに都合のよいデータに改ざんしてしまわないように気をつけなければならない．(フローサイトメトリー ～「前にならえ」並べて順に数えます～ 金山 直樹 生物工学 第90巻 2012年 第12号 PDF)

 

マルチカラーフローサイトメトリー

複数の種類（波長）の色素を用いることにより、複数のマーカー分子を用いて、細胞のタイプを分けることができます。

Multicolor Panel Building in Flow Cytometry 　Bio-Rad Laboratories 2017/11/13

Lymphocytes分類の例（上の動画６：４７～）
ナチュラルキラー（NK）細胞（全てCD56陽性）の2つのサブセット：CD57陽性、CD57陰性CD16陽性
ナチュラルキラーＴ（NKT）細胞（全てCD3陽性、CD56 陽性）の6個のサブセット：CD8低CD57陰性、CD低CD57陽性、CD8中CD57 陰性、CD8中CD57陽性、CD8高CD57陰性、CD8高CD57 陽性

  1. Multicolor flow cytometry – Understanding the basics [WEBINAR]  FITC and PE (4:08~)

マルチカラーフローサイトメトリーで使われる色素

The fluorochromes used are: fluorescein (FITC), phycoerythrin (PE), Cy5PE and Cy7PE, excited at 488 nm by an argon laser; Texas Red (TR), allophycocyanin (APC), and Cy7APC excited at 595 nm by a pumped dye laser; and cascade blue (CB) and cascade yellow (CY) excited at 407 nm by a violet-enhanced krypton laser. (Cytometry. 1999 May 1;36(1):36-45. Nine color eleven parameter immunophenotyping using three laser flow cytometry. PubMed)

  1. Selecting Reagents for Multicolor Flow Cytometry Holden Maecker and Joe Trotter BD Biosciences, San Jose June 2012 
  2. Commonly Used Fluorochromes and Their Properties (umc.edu)
  3. Fluorophores (Flow Cytometry at Einstein) When performing multicolor flow cytometric analysis, a major factor in the success of the analysis is the choice of which antibody to use with which fluorochrome. There are often many “correct” combinations possible. 

 

Tandem dyes for flow cytometry 

Tandem dyes comprise a small fluorophore covalently coupled to another fluorophore. When the first dye is excited and reaches its maximal excited electronic singlet state, its energy is transferred to the second dye (an acceptor molecule). This activates the second fluorophore, which then produces the fluorescence emission. The process is called Förster resonance energy transfer (FRET). (Which Fluorophores are Useful for Flow Cytometry? BIO-RAD)

  1. Flow cytometry APC‐tandem dyes are degraded through a cell‐dependent mechanism Christine Le Roy Nadine Varin‐Blank Florence Ajchenbaum‐Cymbalista Rémi Letestu First published: 08 September 2009 https://doi.org/10.1002/cyto.a.20774 

フローサイトメトリーのプロトコール

  1. Flow cytometryのための表面抗原染色（FITC, PI）　実験プロトコール　東京医科歯科大

 

参考

  1. Take Control of Your Flow Cytometry (Bio-Rad Laboratories 2016/11/23 YOUTUBE 28：49）
  2. FACS – Fluorescence Activated Cell Sorting (Steffen Schmitt (DKFZ)  iBiology Techniques YOUTUBE 30:00)
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