リアルタイムPCRの原理、解析手法の概説、注意点などのまとめ

   




リアルタイムPCRは遺伝子発現量を調べる手法として今ではすっかり普通の実験になりましたが、いざ実験しようとすると再現性が悪かったり、そもそも、遺伝子発現量を議論する(絶対量?相対量?比較対象は何と何?)ためにはどういう実験デザインにしてどんな解析をすべきなのかが初心者にとってはすぐには明らかではなかったりもします。そこで、わかりやすい解説記事をまとめておきます。

 

リアルタイムPCRとは

リアルタイムPCR(real-time PCR)は、定量PCR(quantitative polymerase chain reaction)、qPCR、RT-qPCR (Reverse Transcription quantitative PCR)などとも呼ばれもので、PCR反応で生成されている産物の量を蛍光標識してリアルタイムに測定・記録することにより、指数関数的に増幅している部分を利用して鋳型の量を定量的に解析するものです。絶対的な量を算出するか、相対的なサンプル間の比を算出するかは、実験デザインと解析方法で変わってきます。

リアルタイム PCR は、定量的逆転写 PCR (RT-qPCR) や定量的 PCR (qPCR) としても知られますが、最もパワフルかつ高感度な遺伝子解析技術の一つです。… リアルタイム PCR は、PCR増幅が起こるそのタイミングから核酸の定量を行います。(リアルタイムPCR のコンセプト 遺伝子発現の概要:入門ガイド サーモフィッシャーサイエンティフィック)

 

リアルタイムPCRのデータ解析方法概説

  1. リアルタイムPCRの遺伝子発現解析をより正確に行うために(PDF)(日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社 副島正年,井口潤一 yodosha.co.jp) 検量線を用いた相対的定量、比較Ct法(Livak法)、比較Ct法(Pfaffl法とVandesompele法)
  2. リアルタイム定量PC法の原理と活用 (PDF) (有賀博文 Nippon Suisan Gakkaishi 73(2):292-295 (2007).)PCR初期ではPCRの阻害となる要因がほとんど無いためPCRプロダクトは指数関数的に増幅する
  3. 絶対定量と比較定量の違いとは?リアルタイムPCRの主な4つのデータ解析方法(サーモフィッシャーサイエンティフィック)

  4. リアルタイムPCR再入門(PDF)(BIO-RAD)

 

検量線法(絶対定量法)

絶対定量法とは、あらかじめ濃度の分かっている目的産物のDNAを段階希釈し、希釈系列を用いてReal time PCRを行い検量線を書き、濃度不明のサンプルのCt値を検量線にあてはめコピー数を計算するものである。(リアルタイムPCR ウィキペディア)

  1. リアルタイムPCRによる多種細胞間の発現量の比較(Biotechnical Forum)

 

比較Ct法(相対定量法)

ΔΔCt法は、比較Ct法(comparative Ct method) 、2(-Delta Delta C(T)) Methodなどとも呼ばれます。Livak and Schmittgen 2001の論文で計算の過程が丁寧にわかりやすいく説明されています。

  1. Relative Quantitation Using Comparative CT Getting Started Guide (120-page PDF)ThermoFisher Scientific)
  2. 比較Ct法では,
    ⊿Ct=ターゲット遺伝子Ct-内在性コントロールCt(チューブ毎の値で算出)
    ⊿⊿C=各サンプル⊿Ct-基準サンプルの平均⊿Ct 
    得られた⊿⊿Ctを2^(-⊿⊿Ct)にあてはめてコピー数の比較を行う
    の3つの計算を行って比較します.(qPCRデータのまとめ方が分かりません。(2) YAHOO!JAPAN知恵袋)
  3. デルタデルタCT法でのthresholdの設定(Bio Technica lForum)
  4. 検量線をひかずに定量する比較Ct法の実験データ|今こそ本気で徹底理解! リアルタイムPCR講座 第14回(サーモフィッシャーサイエンティフィック)

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ΔΔCt法と検量線法とどちらを使うべきか

  1. リアルタイムqPCRの定量化。ベターなのはどちら?(jikken110.com)

 

定量PCRにおいて遺伝子発現量を遺伝子間で比較することの是非に関して

  1. リアルタイムPCRで遺伝子間の発現量を比べることは可能か(Biotechnical Forum)
  2. How I can compare a relative ratio of the basal mRNA expression of 2 genes in the same cell line by qRT-PCR? (ResearchGate)

  3. Can I compare the expression of two genes only based on their Ct value? (ResearchGate)

  4. How to determine relative expression of genes compared to a reference gene using qPCR Ct values? (ResearchGate) I do not have treated and untreated samples. I just want to know how much of gene A is expressed relative to gene B and/or the reference gene.
  5. Is it possible to compare abundance of isoforms by qPCR(PROTOCOL ONLINE)

 

リアルタイムPCR実験の実際

  1. リアルタイム PCR の予備実験(PDF)(med.kyushu-u.ac.jp)リアルタイム PCR がなかなかうまくいかない、という方の中には予備実験をされてない方が多くいらっしゃいます。実際に大量のサンプルをかける前に、下記のことをご確認ください。

 

リアルタイムPCR実験のトラブルシューティング

  1. トラブルシューティング (PDF)(takara-bio.co.jp)
  2. これでもう失敗しない!リアルタイムPCRに失敗する4つの問題点と解決策をご紹介 (サーモフィッシャーサイエンティフィック)

 

リアルタイムPCRに関する参考ウェブサイト

  1. タカラバイオ リアルタイムPCR実験ガイド はじめてのリアルタイムPCR:リアルタイムPCRによる定量の原理、装置と検出方法、プライマー設計、実験プロトコール、解析方法 リアルタイムRT-PCRによる遺伝子発現解析:リアルタイムPCRの基礎知識,リアルタイムRT-PCR実験法,解析法,トラブルシューティング リアルタイムPCR実践編:プライマー設計ガイドライン, インターカレーター法によるリアルタイムRT-PCR(用意するもの、プロトコール、PCR反応条件、留意点) リアルタイムPCRの応用: 遺伝子発現解析,DNAマイクロアレイ結果の検証,siRNA効果の確認,病原菌遺伝子の検出・定量,SNPsのタイピング Q&A:リアルタイムPCR実験ガイドのQ&A
  2. バイオラッド リアルタイムPCR再入門(PDF)
  3. Relative quantification Michael W. Pfaffl in: Real-time PCR. Published by International University Line (Editor: T. Dorak), p 63-82
  4. https://www.gu.se/digitalAssets/1125/1125331_ABI_-_Guide_Relative_Quantification_using_realtime_PCR.pdf
  5. http://bioanalysisforum.jp/images/2018_9thJBFS/P6_DG2017-33.pdf

 

リアルタイムPCRデータの解析方法に関する論文

  1. An improvement of the 2ˆ(–delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinforma Biomath. 2013 Aug; 3(3): 71–85. (PubMed PMC4280562)
  2. Livak and Schmittgen 2001 

 

Rで解析するリアルタイムPCRデータ

  1. Analysis of real-time qPCR data 2018-07-24 Mahmoud Ahmed

 - データ解析の手法, 実験手技・プロトコール, 遺伝子発現解析実験