Category Archives: 測定・観察技術

RNAの可視化技術 MS2タグ法

生きた細胞内でRNAの局在を蛍光観察する手法の一つに、バクテリオファージMS2のRNA結合タンパク質(キャプシドの構成要素であるコートタンパク質)とGFPとの融合タンパク質を蛍光プローブとして用いて可視化する方法があります。

 

MS2 system for fluorescent labeling of RNAs in living cells

Robert Singer (Einstein) 2: RNA Localization: Following Single mRNAs from Birth to Death (iBiology 2018/08/20)

 

MS2タグ法やRNA可視化手法の一般向け解説

  1. MS2 tagging (Wikipedia)
  2. Live and In Color How to track RNA in living cells (SARAH WEBB Apr 1, 2012 TheScientist) “The original technique for tracking RNA inside living cells, developed about 15 years ago, uses GFP as the fluorescent reporter molecule. Previously, researchers had used the coat protein from the MS2 bacteriophage, which binds to a defined 19-nucleotide sequence of RNA, as a way to capture RNA and RNA-binding proteins. By fusing GFP to this MS2 protein, Robert Singer and his colleagues at Albert Einstein College of Medicine in Bronx, New York, first demonstrated that they could follow RNA as it migrated within cells (Molecular Cell, 2:437-45, 1998).”

 

MS2タグ法およびmRNA可視化方法のレビュー論文

  1. 細胞内mRNAの選択的蛍光標識とイメージングによる細胞機能解析 (ライブイメージングを利用した細胞・生体の機能解析 東京大学 大学院薬学系研究科 生体分析化学教室 船津高志 Drug Delivery System 31―2, 2016) 特定の配列を持ったRNAと、それに結合する蛍光性タンパク質を同時に発現させる方法である。最も多用されているのはバクテリオファージMS2のコートタンパク質である(図1D)9)。このコートタンパク質が結合する配列を持ったmRNAを細胞内で発現させる。一方、MS2コートタンパク質とGFP(Green fluorescent protein)との融合タンパク質(MS2―GFP)も同時に細胞内に発現させる。細胞質において mRNAを観察する場合には、mRNAに結合していないMS2―GFP が背景光として観察の妨げにならないよう核移行シグナルを付加しておき、これが核に集まるようにしておく。また、1分子の mRNA が明瞭に観察できるように、MS2コートタンパク質の配列を24回繰り返したものを標的mRNAに付与することが行われている。この場合、最大48個のGFP がmRNAに結合できる。
  2. Current techniques for visualizing RNA in cells. Lilith V.J.C. Mannack, Sebastian Eising and Andrea Rentmeistera. Version 1. F1000Res. 2016; 5: F1000 Faculty Rev-775. “A number of bacteriophage-derived RNA-binding proteins have been used to mark RNA in cells. The most notable of these is the MS2-MS2 coat protein (MS2-MCP) system (Figure 2A). This comprises a green fluorescent protein (GFP)-fused version of the bacteriophage MCP (an RNA-binding protein that recognizes a specific RNA sequence-determined hairpin) and the RNA of interest extended by multiple MS2-binding sites (MBS).”
  3. In the right place at the right time: visualizing and understanding mRNA localization. (Free author manuscript) Buxbaum AR, Haimovich G, Singer RH. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015 Feb;16(2):95-109. doi: 10.1038/nrm3918. Epub 2014 Dec 30. 
  4. Fluorescent Probes for Nucleic Acid Visualization in Fixed and Live Cells.(Full text at Researchgate) Boutorine et al., Molecules 2013, 18, 15357-15397.  “Two engineered plasmids are expressed in the living cells. The first one codes for the green fluorescent protein fused with the RNA-binding protein from the MS2 bacteriophage. The second one codes for the reporter RNA that contains in its 3′-untranslated region several copies of a unique hairpin fragment from the MS2 genome that interacts with the MS2 RNA-binding protein.”

 

MS2タグの開発および応用に関する原著論文

  1. 生細胞におけるリアルタイムでの1分子のmRNAからの翻訳のダイナミクスの可視化および定量 (森崎達也・Timothy J. Stasevich 2016 ライフサイエンス新着論文レビュー)
  2. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Golding I, Paulsson J, Zawilski SM, Cox EC. Cell. 2005 Dec 16;123(6):1025-36.
  3. Localization of ASH1 mRNA Particles in Living Yeast. Edouard Bertrand, Pascal Chartrand, Matthias Schaefer, Shailesh M. Shenoy, Robert H. Singer, Roy M. Long. Molecular Cell Oct 01, 1998;2(4):437-445. “We constructed a two-plasmid system in yeast. On one plasmid, the GFP sequence was fused to coding sequences for the single-stranded RNA phage capsid protein MS2 (Fouts et al. 1997). On the second plasmid, six MS2-binding sites, each consisting of a 19-nucleotide RNA stem loop (Valegard et al. 1997) were inserted into a reporter mRNA (Figure 1A), to provide increased signal from multiple bound GFPs. “

 

バクテリオファージMS2の生物学

  1. Bacteriophage MS2 (Wikipedia)
  2. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.(PMC413242) D S Peabody. EMBO J. 1993 Feb; 12(2): 595–600.

 

用語

  1. ステムループ:RNAはDNAとは異なり基本的は一本鎖ですが、同じ鎖の中で部分的に二本鎖の構造を取る部分があり、その形からステム(「幹」の意味)ループと呼んでいます。(遺伝子のスイッチを入れるタンパク質 ~ RNAのステム・ループをほどく三角形 ~ 2005.4.7 News@KEK)
  2. バクテリオファージMS2:正20面体の一本鎖 (+) RNAウイルスで大腸菌に感染する。MS2のゲノムは小さくて、4つの遺伝子しかなく、maturation遺伝子(A遺伝子),coat遺伝子(MS2のキャプシド),lysis遺伝子(大腸菌を溶菌させる),replicase遺伝子(MS2ゲノムRNAを複製)からなる。(ウィキペディア

 

 

全反射照明蛍光顕微鏡(TIRF) 細胞表面や1分子イメージングなどへの応用

全反射照明蛍光顕微鏡とは

全反射照明蛍光顕微鏡 (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope ;TIRFMまたはTIRF) は、通常の落射蛍光顕微鏡のようにサンプル全体に真正面から励起光を当てることをせず、観察対象となるサンプルが載っているガラス表面に対して、角度をつけて斜め方向から励起光を照射します。この角度が大きい場合には、励起光はガラスの境界面で屈折して通り抜けずに全反射します。しかし、全反射が起きるときにガラスのごくごく近傍(100nm程度)までは光が「滲みだす」ため(エバネッセント光)、ガラス表面に近い100nm程度までのサンプルの部分のみが極めて局所的に励起光で照らされることになります。このような照明方法が全反射照明(TIRF)と呼ばれます。

  1. 界面近傍のみを高感度に観察できる「全反射照明蛍光顕微鏡 (TIRF)」(NIKON)

  2. Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy An Introduction (Leica MIcrosystems March 12, 2012 Tutorial)
  3. Learn & Share: TIRF Microscopy (LEICA)

  4. TIRFM(実験医学オンライン キーワード)

 

全反射照明蛍光顕微鏡の利点

蛍光観察において、観察したい対象以外からの蛍光シグナルは全てノイズ、もしくは望まないバックグラウンドであり、視たいシグナルを埋もれさせてしまいます。しかし、全反射照明を用いるとサンプルを置いているガラス表面近傍以外には励起光が照射されていないので余計な蛍光も発生しません。もしスライドガラス近傍100nm程度の部分だけを観察したいのであれば、極めて低バックグラウンドで蛍光シグナルを観察することができるため、蛍光色素で標識されたたった1分子のタンパク質を可視化することすら可能になります。

 

全反射照明蛍光顕微鏡の欠点

TIRFMの欠点は利点の裏返しです。すなわち、観察できる対象がガラスの近傍100nm程度に存在するものに限られます。それよりも離れた場所は励起できないので観察できません。生体の内部で生じる現象は観察できないということになります。ガラス上の細胞を観察する場合でも、細胞のガラスに接している局所のみが観察可能で、細胞の内部深いところは観察できません。

 

全反射照明蛍光顕微鏡(TIRF)の解説動画

Microscopy: Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy (Daniel Axelrod)

  • 6:17 プリズム型TIRFの説明
  • 8:22 対物レンズ型(プリズム不要)TIRFM(高開口数対物レンズを利用)の説明
  • 11:53 光源としてレーザーでなく水銀ランプを使うTIRFの説明
  • 14:12 プリズム型TIRFと対物レンズ利用のTIRFとの比較
  • 39:38 Conclusion(まとめ)

 

全反射照明蛍光顕微鏡の応用:1分子イメージング顕微鏡

全反射によるエバネッセント照明を利用して生物分子モーターであるキネシンを蛍光標識し、1分子のキネシンが微小管上を滑り運動する様子を観察した例を紹介する。(1分子蛍光イメージングの生命科学研究への応用 船津高志 東京大学大学院薬学系研究科生体分析化学教室 DOJIN NEWS)

  1. 拡散・キネティクス統計解析法の開発

 

TIRFを用いた細胞イメージング、分子モーターイメージングなど

  1. Imaging receptors, ion channels and molecular motors in live cells using TIRF microscopy. (YOUTUBE 51:44) Recorded at NPL on 21 March 2013. National Physical Laboratory 2013/03/22 に公開 Justin Molloy from MRC National Institute for Medical Research.

Kinesin walking on Microtubules

GFP tagged Kinesin walking on TRITC labled microtubules. Composite image created from epiflorescence and TIRF microscopy.

Transport on microtubules – Sebastian Maurer
 

The transport of a fluorescently labelled cargo (cyan) by a kinesin motor protein towards microtubule plus ends is visualized here.

 

オリンパス社のTIRF

  1. エバネッセント照明用対物レンズ APON 60XOTIRFなど
  2. Olympus cellTIRF | Excellent Multicolor TIRF Imaging (YOUTUBE 0:52

  3. cell^TIRF™ Illuminator(Olympus America)(PDF)

ニコン社のTIRF

  1. Nikon CFI アポクロマート TIRFシリーズ対物レンズ 高開口数1.49を実現し、高S/Nの明るい画像が取得できる対物レンズです。TIRF観察や1分子イメージング、レーザートラッピングに 

プリズム型TIRF

  1. 波モード全反射照明ユニット (WG-TIRF) 有限会社シーアンドアイ(C&I)

WG-TIRFの紹介と使い方(基本編)

クライオ電子顕微鏡法(Cryo-EM)

クライオ電顕とは?

クライオ電子顕微鏡法は、生体内の構造を染色することなく生のまま凍らせて観察する方法です。従って、「クライオ電子顕微鏡」という顕微鏡があるわけではなく、高性能な透過型電子顕微鏡(Transmission electron microscopy, 通常 TEMと略称されます)に、低温(-160 ~ -270度) のまま観察出来る装備(クライオホルダーや、試料汚染防止装置)を備えたものです。(クライオ電子顕微鏡法 KIKKAWA LAB)

クライオ電顕の手順

A 3 minute introduction to CryoEM 3分で学ぶクライオ電顕の手順(音声無し)

クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析法の原理の解説

Part 6: SPA Reconstruction Basic Workflow – G. Jensen(caltech 2015/02/05 に公開 31分52秒) 単粒子解析法(single particle analysis, SPA)の基本的なワークフロー

Part 6: Single Particle Analysis – G. Jensen(caltech 2015/02/05 に公開 21分58秒)単粒子解析法

クライオ電顕に関する講義

Yifan Cheng (UCSF & HHMI) 1: Single Particle Cryo-EM (34分06秒)

12:24- クライオ電顕のサンプル調整法、原理

 

クライオ電顕に関するセミナー動画

Lecture “Cryo-Electron Microscopy Method in Structure Biology” by Ping Zhu in SibFU

 

クライオ電顕のサンプル調整法

NRAMM/SEMC CryoEM Grid Preparation Workshop(NRAMM SEMC 2017/05/05 に公開)

40:32- Electron cryomicroscopy of membrane proteins (膜タンパク質のクライオ電子顕微鏡法)John Rubinstein

 

  1. 高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集:クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる(JoVE)

 

クライオ電顕データの解析方法

Workshop on Computational Methods for CryoEM

 

参考

  1. 【速報】2017年ノーベル化学賞は「クライオ電子顕微鏡の開発」に! (Chem-Station 2017/10/4)
  2. クライオEM (GATAN)
  3. National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM)