RNAの可視化技術 MS2タグ法

   




生きた細胞内でRNAの局在を蛍光観察する手法の一つに、バクテリオファージMS2のRNA結合タンパク質(キャプシドの構成要素であるコートタンパク質)とGFPとの融合タンパク質を蛍光プローブとして用いて可視化する方法があります。

 

MS2 system for fluorescent labeling of RNAs in living cells

Robert Singer (Einstein) 2: RNA Localization: Following Single mRNAs from Birth to Death (iBiology 2018/08/20)


 

MS2タグ法やRNA可視化手法の一般向け解説

  1. MS2 tagging (Wikipedia)
  2. Live and In Color How to track RNA in living cells (SARAH WEBB Apr 1, 2012 TheScientist) “The original technique for tracking RNA inside living cells, developed about 15 years ago, uses GFP as the fluorescent reporter molecule. Previously, researchers had used the coat protein from the MS2 bacteriophage, which binds to a defined 19-nucleotide sequence of RNA, as a way to capture RNA and RNA-binding proteins. By fusing GFP to this MS2 protein, Robert Singer and his colleagues at Albert Einstein College of Medicine in Bronx, New York, first demonstrated that they could follow RNA as it migrated within cells (Molecular Cell, 2:437-45, 1998).”

 

MS2タグ法およびmRNA可視化方法のレビュー論文

  1. 細胞内mRNAの選択的蛍光標識とイメージングによる細胞機能解析 (ライブイメージングを利用した細胞・生体の機能解析 東京大学 大学院薬学系研究科 生体分析化学教室 船津高志 Drug Delivery System 31―2, 2016) 特定の配列を持ったRNAと、それに結合する蛍光性タンパク質を同時に発現させる方法である。最も多用されているのはバクテリオファージMS2のコートタンパク質である(図1D)9)。このコートタンパク質が結合する配列を持ったmRNAを細胞内で発現させる。一方、MS2コートタンパク質とGFP(Green fluorescent protein)との融合タンパク質(MS2―GFP)も同時に細胞内に発現させる。細胞質において mRNAを観察する場合には、mRNAに結合していないMS2―GFP が背景光として観察の妨げにならないよう核移行シグナルを付加しておき、これが核に集まるようにしておく。また、1分子の mRNA が明瞭に観察できるように、MS2コートタンパク質の配列を24回繰り返したものを標的mRNAに付与することが行われている。この場合、最大48個のGFP がmRNAに結合できる。
  2. Current techniques for visualizing RNA in cells. Lilith V.J.C. Mannack, Sebastian Eising and Andrea Rentmeistera. Version 1. F1000Res. 2016; 5: F1000 Faculty Rev-775. “A number of bacteriophage-derived RNA-binding proteins have been used to mark RNA in cells. The most notable of these is the MS2-MS2 coat protein (MS2-MCP) system (Figure 2A). This comprises a green fluorescent protein (GFP)-fused version of the bacteriophage MCP (an RNA-binding protein that recognizes a specific RNA sequence-determined hairpin) and the RNA of interest extended by multiple MS2-binding sites (MBS).”
  3. In the right place at the right time: visualizing and understanding mRNA localization. (Free author manuscript) Buxbaum AR, Haimovich G, Singer RH. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015 Feb;16(2):95-109. doi: 10.1038/nrm3918. Epub 2014 Dec 30. 
  4. Fluorescent Probes for Nucleic Acid Visualization in Fixed and Live Cells.(Full text at Researchgate) Boutorine et al., Molecules 2013, 18, 15357-15397.  “Two engineered plasmids are expressed in the living cells. The first one codes for the green fluorescent protein fused with the RNA-binding protein from the MS2 bacteriophage. The second one codes for the reporter RNA that contains in its 3′-untranslated region several copies of a unique hairpin fragment from the MS2 genome that interacts with the MS2 RNA-binding protein.”

 

MS2タグの開発および応用に関する原著論文

  1. 生細胞におけるリアルタイムでの1分子のmRNAからの翻訳のダイナミクスの可視化および定量 (森崎達也・Timothy J. Stasevich 2016 ライフサイエンス新着論文レビュー)
  2. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Golding I, Paulsson J, Zawilski SM, Cox EC. Cell. 2005 Dec 16;123(6):1025-36.
  3. Localization of ASH1 mRNA Particles in Living Yeast. Edouard Bertrand, Pascal Chartrand, Matthias Schaefer, Shailesh M. Shenoy, Robert H. Singer, Roy M. Long. Molecular Cell Oct 01, 1998;2(4):437-445. “We constructed a two-plasmid system in yeast. On one plasmid, the GFP sequence was fused to coding sequences for the single-stranded RNA phage capsid protein MS2 (Fouts et al. 1997). On the second plasmid, six MS2-binding sites, each consisting of a 19-nucleotide RNA stem loop (Valegard et al. 1997) were inserted into a reporter mRNA (Figure 1A), to provide increased signal from multiple bound GFPs. “

 

バクテリオファージMS2の生物学

  1. Bacteriophage MS2 (Wikipedia)
  2. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.(PMC413242) D S Peabody. EMBO J. 1993 Feb; 12(2): 595–600.

 

用語

  1. ステムループ:RNAはDNAとは異なり基本的は一本鎖ですが、同じ鎖の中で部分的に二本鎖の構造を取る部分があり、その形からステム(「幹」の意味)ループと呼んでいます。(遺伝子のスイッチを入れるタンパク質 ~ RNAのステム・ループをほどく三角形 ~ 2005.4.7 News@KEK)
  2. バクテリオファージMS2:正20面体の一本鎖 (+) RNAウイルスで大腸菌に感染する。MS2のゲノムは小さくて、4つの遺伝子しかなく、maturation遺伝子(A遺伝子),coat遺伝子(MS2のキャプシド),lysis遺伝子(大腸菌を溶菌させる),replicase遺伝子(MS2ゲノムRNAを複製)からなる。(ウィキペディア

 

 


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