全反射照明蛍光顕微鏡とは

全反射照明蛍光顕微鏡 (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope ;TIRFMまたはTIRF) は、通常の落射蛍光顕微鏡のようにサンプル全体に真正面から励起光を当てることをせず、観察対象となるサンプルが載っているガラス表面に対して、角度をつけて斜め方向から励起光を照射します。この角度が大きい場合には、励起光はガラスの境界面で屈折して通り抜けずに全反射します。しかし、全反射が起きるときにガラスのごくごく近傍（１００ｎｍ程度）までは光が「滲みだす」ため（エバネッセント光）、ガラス表面に近い１００ｎｍ程度までのサンプルの部分のみが極めて局所的に励起光で照らされることになります。このような照明方法が全反射照明（ＴＩＲＦ）と呼ばれます。

1. 界面近傍のみを高感度に観察できる「全反射照明蛍光顕微鏡 (TIRF)」(NIKON)

2. Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy An Introduction (Leica MIcrosystems March 12, 2012 Tutorial)

3. Learn & Share: TIRF Microscopy (LEICA)

4. TIRFM（実験医学オンライン　キーワード）

 

全反射照明蛍光顕微鏡の利点

蛍光観察において、観察したい対象以外からの蛍光シグナルは全てノイズ、もしくは望まないバックグラウンドであり、視たいシグナルを埋もれさせてしまいます。しかし、全反射照明を用いるとサンプルを置いているガラス表面近傍以外には励起光が照射されていないので余計な蛍光も発生しません。もしスライドガラス近傍１００ｎｍ程度の部分だけを観察したいのであれば、極めて低バックグラウンドで蛍光シグナルを観察することができるため、蛍光色素で標識されたたった１分子のタンパク質を可視化することすら可能になります。

 

全反射照明蛍光顕微鏡の欠点

ＴＩＲＦＭの欠点は利点の裏返しです。すなわち、観察できる対象がガラスの近傍１００ｎｍ程度に存在するものに限られます。それよりも離れた場所は励起できないので観察できません。生体の内部で生じる現象は観察できないということになります。ガラス上の細胞を観察する場合でも、細胞のガラスに接している局所のみが観察可能で、細胞の内部深いところは観察できません。

 

全反射照明蛍光顕微鏡(TIRF)の解説動画

Microscopy: Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy (Daniel Axelrod)

• 6:17 プリズム型TIRFの説明
• 8：22　対物レンズ型（プリズム不要）TIRFM（高開口数対物レンズを利用）の説明
• 11：53　光源としてレーザーでなく水銀ランプを使うＴＩＲＦの説明
• 14：12　プリズム型ＴＩＲＦと対物レンズ利用のＴＩＲＦとの比較
• 39：38　Conclusion（まとめ）

 

全反射照明蛍光顕微鏡の応用：1分子イメージング顕微鏡

全反射によるエバネッセント照明を利用して生物分子モーターであるキネシンを蛍光標識し、1分子のキネシンが微小管上を滑り運動する様子を観察した例を紹介する。(1分子蛍光イメージングの生命科学研究への応用 船津高志 東京大学大学院薬学系研究科生体分析化学教室 DOJIN NEWS)

1. 拡散・キネティクス統計解析法の開発

 

ＴＩＲＦを用いた細胞イメージング、分子モーターイメージングなど

1. Imaging receptors, ion channels and molecular motors in live cells using TIRF microscopy. (YOUTUBE　51：44) Recorded at NPL on 21 March 2013.　National Physical Laboratory　2013/03/22 に公開　Justin Molloy from MRC National Institute for Medical Research.

Kinesin walking on Microtubules

GFP tagged Kinesin walking on TRITC labled microtubules. Composite image created from epiflorescence and TIRF microscopy.

Transport on microtubules – Sebastian Maurer
 

The transport of a fluorescently labelled cargo (cyan) by a kinesin motor protein towards microtubule plus ends is visualized here.

 

オリンパス社のＴＩＲＦ

1. エバネッセント照明用対物レンズ　APON 60XOTIRFなど

2. Olympus cellTIRF | Excellent Multicolor TIRF Imaging (YOUTUBE 0:52) 

3. cell^TIRF™ Illuminator（Olympus America)(PDF)

ニコン社のＴＩＲＦ

1. Nikon CFI アポクロマート TIRFシリーズ対物レンズ 高開口数1.49を実現し、高S/Nの明るい画像が取得できる対物レンズです。TIRF観察や１分子イメージング、レーザートラッピングに 

プリズム型ＴＩＲＦ

1. 導波モード全反射照明ユニット （WG-TIRF） 有限会社シーアンドアイ（C&I)

WG-TIRFの紹介と使い方（基本編）