Category Archives: 遺伝子発現解析実験

マイクロアレイ解析の原理、受託費用

マイクロアレイとは:マイクロアレイの原理

  1. Introduction to Microarray Analysis Affymetrix GeneChip technology Katerina Taˇskova 11 March 2016
  2. アジレントのマイクロアレイ

 

マイクロアレイデータ解析

  1. Chapter 11 An Introduction to Microarray Data Analysis. M. Madan Babu

 

マイクロアレイ受託サービス選びのポイント

  1. マイクロアレイの受託解析を利用する際に知っておきたいポイント　サーモフィッシャーサイエンティフィック　2017年4月10日

 

マイクロアレイ受託サービスにかかる費用の例

  1. フィルジェン　全転写産物発現解析 Gene ST Array　Human Gene 2.0 ST Array 86,000円/Sample　遺伝子発現解析 3‘IVT Array　Human Genome U133 Plus 2.0 Array 93,000円/Sample　遺伝子レベルトランスクリプトーム解析 Clariom Ｓ Assay　解析あり : 70,000円/Sample 解析なし : 68,000円/Sample　包括的トランスクリプトーム解析 Clariom D Assay　解析あり : 100,000円/Sample 解析なし : 95,000円/Sample

 

マイクロアレイの受託サービス業者一覧

  1. マイクロアレイ 　和研薬　Agilent、Affymetrix、Illuminaの3社のアレイの使用が可能。データの前処理（クオリティチェックと正規化）、発現変動している遺伝子の算出・抽出、発現変動遺伝子群の解析（データマイニング）。論文に掲載する際のヒートマップの作成や、解析方法の記述、マイクロアレイデータの公開データベース NCBI GEO（Gene Expression Omnibus）への登録までサポート。
  2. ConPathGO DNAチップ研究所　遺伝子発現マイクロアレイ実験・発現解析・パスウェイ解析をトータルにサポートする受託サービス。アジレント社製マイクロアレイで実験。チップの違いによる誤差や、サンプル間のデータ偏りを正規化し（ノーマライズ）、マトリクスを作成。生データおよびノーマライズデータに、フラグ情報、アノテーション情報をつけ、有効データを抽出し。
  3. Applied BiosystemsTM GeneChipTMアレイ　RIKEN GENESIS　発現解析用のアレイは、3’ IVT Array, Gene Array, ClariomTMD Array, ClariomTM S Arrayに分けられます。
  4. マクロジェン/コスモ・バイオ　Agilent、illumina および Affymetrix の Chip を用いてマイクロアレイ解析サービスを提供
  5. Agilent Array発現解析　タカラバイオ　ご要望に応じて、微量total RNA（500 pg以上、濃度100 pg/μl以上）からの解析、解析後のデータマイニング
  6. フィルジェン　World StandardなDNAマイクロアレイである、Thermo Fisher Scientific社(applied biosystems/affymetrix)のGeneChipTM Arraysを用いて受託解析サービス
  7. アジレントアレイ解析サービス　北海道システム・サイエンス株式会社
  8. DNAマイクロアレイ解析受託　株式会社トランスジェニック
  9. マイクロアレイ受託解析／Affymetrix (新･Applied Biosystems‎) GeneChip受託解析 ジェネティックラボ

 

無料統計ソフトRを用いたマイクロアレイデータ解析

  1. bioconductor.org　
  2. Using R to draw a Heatmap from Microarray Data
  3. An end to end workflow for differential gene expression using Affymetrix microarrays
    Bernd Klaus and Stefanie Reisenauer 14 September 2018 “walk through an end-to-end Affymetrix microarray differential expression workflow using Bioconductor packages.”  “The data set used (1) is from a paper studying the differences in gene expression in inflamed and non-inflamed tissue. 14 patients suffering from Ulcerative colitis (UC) and 15 patients with Crohn’s disease (CD) were tested, and from each patient inflamed and non-inflamed colonic mucosa tissue was obtained via a biopsy. This is a typical clinical data set consisting of 58 arrays in total.”
  4. ARRAYANALYSIS.ORG – ILLUMINA PRE-PROCESSING PIPELINE – DOCUMENT VERSION: 1.0.0　This guide will help you in the installation and/or use of the QC & pre-processing of Illumina arrays pipeline. All source code has been written in R and is open-source, available under the Apache License version
    2.0. It is available on our Download page.
  5. (Rで)マイクロアレイデータ解析 (u-tokyo.ac.jp last modified 2019/03/17, since 2005)
  6. マイクロアレイデータを解析する　TOGOTV　マイクロアレイ実験データセットを検索&生データをダウンロードする　データの前処理（正規化）データの生物学的解釈 
  7. A Tutorial Review of Microarray Data Analysis　Alex Sánchez and M. Carme Ruíz de Villa July 7, 2008 55-page PDF

 

マイクロアレイ vs. RNAseq の議論

  1. RNA-SEQUENCING VS. MICROARRAYS. When, if ever, is using microarrays better than RNA-seq?  25 April 2018 @ 13:47 Thomas Liuksiala
  2. Transcriptomics technologies.  Lowe et al., May 18, 2017 PLOS Computational Biology
  3. Choosing between microarray and RNA-seq for gene expression studies and more? researchgate.net Asked 6th Jun, 2017
  4. An Array of Options. A guide for how and when to transition from the microarray to RNA-seq. KATE YANDELL Jun 1, 2015 TheScientist
  5. An investigation of biomarkers derived from legacy microarray data for their utility in the RNA-seq era.　Genome Biol. 2014 Dec 3;15(12):523. doi: 10.1186/s13059-014-0523-y.
  6. RNA-Seq and Microarrays Analyses Reveal Global Differential Transcriptomes of Mesorhizobium huakuii 7653R between Bacteroids and Free-Living Cells. PLoS One. 2014; 9(4): e93626.
  7. 遺伝子発現差解析はマイクロアレイ？、それともRNAseq？ okayama-u.ac.jp　2012-12-19 
  8. RNA-seq: An assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Published in Advance Genome Res. 2008. 18: 1509-1517

 

参考

  1. Making Informed Choices about Microarray Data Analysis. Mark Reimers. PLoS Comput Biol. 2010 May; 6(5): e1000786. PMCID: PMC2877726
  2. Analysis of microarray experiments of gene expression profiling. Tarca et al.Am J Obstet Gynecol. 2006 Aug; 195(2): 373–388. PMC 
  3. Fundamentals of cDNA microarray data analysis Yuk Fai Leung and Duccio Cavalieri TRENDS in Genetics Vol.19 No.11 November 2003
  4. Capturing best practice for microarray gene expression data analysis　2003年

リアルタイムPCRの原理、解析手法の概説、注意点などのまとめ

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リアルタイムPCRは遺伝子発現量を調べる手法として今ではすっかり普通の実験になりましたが、いざ実験しようとすると再現性が悪かったり、そもそも、遺伝子発現量を議論する（絶対量？相対量？比較対象は何と何？）ためにはどういう実験デザインにしてどんな解析をすべきなのかが初心者にとってはすぐには明らかではなかったりもします。そこで、わかりやすい解説記事をまとめておきます。

 

リアルタイムPCRとは

リアルタイムPCR（real-time PCR）は、定量PCR（quantitative polymerase chain reaction）、qPCR、RT-ｑPCR (Reverse Transcription quantitative PCR)などとも呼ばれもので、PCR反応で生成されている産物の量を蛍光標識してリアルタイムに測定・記録することにより、指数関数的に増幅している部分を利用して鋳型の量を定量的に解析するものです。絶対的な量を算出するか、相対的なサンプル間の比を算出するかは、実験デザインと解析方法で変わってきます。

リアルタイム PCR は、定量的逆転写 PCR (RT-qPCR) や定量的 PCR (qPCR) としても知られますが、最もパワフルかつ高感度な遺伝子解析技術の一つです。…　リアルタイム PCR は、PCR増幅が起こるそのタイミングから核酸の定量を行います。（リアルタイムPCR のコンセプト 遺伝子発現の概要：入門ガイド　サーモフィッシャーサイエンティフィック）

 

リアルタイムPCRのデータ解析方法概説

  1. リアルタイムPCRの遺伝子発現解析をより正確に行うために（PDF)(日本バイオ･ラッド ラボラトリーズ株式会社　副島正年，井口潤一 yodosha.co.jp)　検量線を用いた相対的定量、比較Ct法（Livak法）、比較Ct法（Pfaffl法とVandesompele法）
  2. リアルタイム定量PC法の原理と活用 (PDF) （有賀博文　Nippon Suisan Gakkaishi 73(2):292-295 (2007).）PCR初期ではPCRの阻害となる要因がほとんど無いためPCRプロダクトは指数関数的に増幅する

  3. 絶対定量と比較定量の違いとは？リアルタイムPCRの主な4つのデータ解析方法（サーモフィッシャーサイエンティフィック）

  4. リアルタイムPCR再入門（PDF)(BIO-RAD)

 

検量線法（絶対定量法）

絶対定量法とは、あらかじめ濃度の分かっている目的産物のDNAを段階希釈し、希釈系列を用いてReal time PCRを行い検量線を書き、濃度不明のサンプルのCt値を検量線にあてはめコピー数を計算するものである。（リアルタイムPCR　ウィキペディア）

  1. リアルタイムPCRによる多種細胞間の発現量の比較（Biotechnical Forum)

 

比較Ct法（相対定量法）

ΔΔCt法は、比較Ct法(comparative Ct method) 、2(-Delta Delta C(T)) Methodなどとも呼ばれます。Livak and Schmittgen 2001の論文で計算の過程が丁寧にわかりやすいく説明されています。

  1. Relative Quantitation Using Comparative CT Getting Started Guide (120-page PDF)ThermoFisher Scientific)
  2. 比較Ct法では，
    ⊿Ct＝ターゲット遺伝子Ct－内在性コントロールCt（チューブ毎の値で算出）
    ⊿⊿C＝各サンプル⊿Ct－基準サンプルの平均⊿Ct 
    得られた⊿⊿Ctを2^(-⊿⊿Ct)にあてはめてコピー数の比較を行う
    の３つの計算を行って比較します．(qPCRデータのまとめ方が分かりません。(2) YAHOO!JAPAN知恵袋)
  3. デルタデルタCT法でのthresholdの設定（Bio　Technica　lForum)

  4. 検量線をひかずに定量する比較Ct法の実験データ｜今こそ本気で徹底理解! リアルタイムPCR講座 第14回（サーモフィッシャーサイエンティフィック）

ΔΔCt法と検量線法とどちらを使うべきか

  1. リアルタイムqPCRの定量化。ベターなのはどちら？（jikken110.com）

 

定量PCRにおいて遺伝子発現量を遺伝子間で比較することの是非に関して

  1. リアルタイムPCRで遺伝子間の発現量を比べることは可能か（Biotechnical Forum)

  2. How I can compare a relative ratio of the basal mRNA expression of 2 genes in the same cell line by qRT-PCR? (ResearchGate)

  3. Can I compare the expression of two genes only based on their Ct value? (ResearchGate)

  4. How to determine relative expression of genes compared to a reference gene using qPCR Ct values? (ResearchGate) I do not have treated and untreated samples. I just want to know how much of gene A is expressed relative to gene B and/or the reference gene.
  5. Is it possible to compare abundance of isoforms by qPCR（PROTOCOL ONLINE)

 

リアルタイムPCR実験の実際

  1. リアルタイム PCR の予備実験（PDF)（med.kyushu-u.ac.jp）リアルタイム PCR がなかなかうまくいかない、という方の中には予備実験をされてない方が多くいらっしゃいます。実際に大量のサンプルをかける前に、下記のことをご確認ください。

 

リアルタイムPCR実験のトラブルシューティング

  1. トラブルシューティング （PDF)(takara-bio.co.jp)
  2. これでもう失敗しない！リアルタイムPCRに失敗する4つの問題点と解決策をご紹介 (サーモフィッシャーサイエンティフィック)

 

リアルタイムPCRに関する参考ウェブサイト

  1. タカラバイオ　リアルタイムPCR実験ガイド　はじめてのリアルタイムPCR:リアルタイムPCRによる定量の原理、装置と検出方法、プライマー設計、実験プロトコール、解析方法　リアルタイムRT-PCRによる遺伝子発現解析:リアルタイムPCRの基礎知識,リアルタイムRT-PCR実験法,解析法,トラブルシューティング　リアルタイムPCR実践編:プライマー設計ガイドライン, インターカレーター法によるリアルタイムRT-PCR（用意するもの、プロトコール、PCR反応条件、留意点）　リアルタイムPCRの応用: 遺伝子発現解析,DNAマイクロアレイ結果の検証,siRNA効果の確認,病原菌遺伝子の検出・定量,SNPsのタイピング　Q＆A:リアルタイムPCR実験ガイドのQ&A
  2. バイオラッド　リアルタイムPCR再入門（PDF)
  3. Relative quantification　Michael W. Pfaffl in: Real-time PCR. Published by International University Line (Editor: T. Dorak), p 63-82
  4. https://www.gu.se/digitalAssets/1125/1125331_ABI_-_Guide_Relative_Quantification_using_realtime_PCR.pdf
  5. http://bioanalysisforum.jp/images/2018_9thJBFS/P6_DG2017-33.pdf

 

リアルタイムPCRデータの解析方法に関する論文

  1. An improvement of the 2ˆ(–delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinforma Biomath. 2013 Aug; 3(3): 71–85. (PubMed PMC4280562)
  2. Livak and Schmittgen 2001 

 

Rで解析するリアルタイムPCRデータ

  1. Analysis of real-time qPCR data　2018-07-24　Mahmoud Ahmed